Выращивание и исследование азотфиксирующих, нитрифицирующих и клубеньковых бактерий

Для изучения азотфиксирующих бактерий, свободно живущих в почве, выращивают накопительную культуру в жидкой среде Эшби, не содержащей азота (рец.24).

В стерильные колбы разливают по 30 мл стерильной среды Эшби и добавляют комочек почвы. На среде Эшби вместе развиваются такие азотфиксаторы, как аэробный Azotobakter chroococcum и анаэробный Clostridium pasterianum. Через 7- 10 дней на поверхности среды появляются бурая пленка из Azotobakter chroococcum. В нижней части среды начинается брожение, сопровождающееся выделением газа с запахом масляной кислоты, что свидетельствует о развитии Clostridium pasteurianum.

При микроскопии мазков из поверхностной пленки обнаруживают круглые клетки Azotobakter chroococcum. В препарате со дна колбы находят споросодержащие клетки Clostridium pasteurianum, имеющие веретенообразную форму.

Исследование нитрифицирующих бактерий проводят методом накопительных культур. Для этого используют минеральную питательную среду, не содержащую органические вещества (рец 25).

Среду разливают в колбы по 50 мл и дробно стерилизуют 20 минут текучим паром в течение 3 дней. Стерильную среду заражают комочками почвы. После посева над средой между горлышком колбы и пробкой помещают полоску стерильной красной лакмусовой бумажки. Посев термостатируют в течение 7-10 дней при температуре 25°С-30°С.

Рост нитрифицирующих бактерий сопровождается образованием аммиака, нитритов и нитратов. Аммиак обнаруживают по изменению окраски полоски лакмусовой бумажки. Нитриты и нитраты определяют смешиванием в белой фарфоровой чашке нескольких капель культуральной жидкости с каплей раствора дифениламина в серной кислоте. Их присутствие обнаруживается посинением жидкости.

Для изучения морфологических свойств нитрифицирующих бактерий из культуральной жидкости готовят мазок, окрашивают фуксином и рассматривают под большим увеличением с масляной иммерсией. Nitrosobakter обнаруживаются в виде овальных клеток, a Nitrobakter - в виде мелких палочек.

Клубеньковые бактерии изучают методами прямой микроскопии и выделения чистой культуры. Для прямой микроскопии от корневой части бобового растения отделяют клубенек, стерильным ножом надрезают и отжимают каплю сока на предметное стекло. Каплю сока разбавляют такой же каплей дистиллированной воды, высушивают, фиксируют и окрашивают фуксином. Микроскопию мазка проводят с использованием масляной иммерсии, В поле зрения будут видны мелкие палочки и бактериоиды.

Для выделения чистой культуры клубеньковых бактерий каплю сока клубенька высевают на плотную питательную среду _: бобовый агар (рец. 26).