Методы количественного учета микроорганизмов

В микробиологической практике часто необходимо не только выделить тот или иной вид, но и определить численность живых микроорганизмов в тех или иных объектах окружающей среды. Для этого используются различные методы количественного учета.

Наиболее распространенным является метод серийных разведений. Этот метод позволяет вести учет только жизнеспособных клеток микроорганизмов.

Метод серийных разведений заключается в том, что в большие или малые бактериологические пробирки разливают соответственно либо по 9, либо по 4,5 мл стерильной водопроводной воды Или стерильного физиологического раствора. Пробирки нумеруют и в первую пробирку вносят 1,0 мл инокулята (если пробирка большая) или 0,5 мл инокулята (если пробирка маленькая). Затем после перемешивания, в том же объеме, каждый раз (обязательно!) новой пипеткой инокулят переносят в следующую пробирку. Количество пробирок в ряду, а следовательно, разведений зависит от предполагаемой микробной загрязненности объекта.

Из полученных разведений делают пересев на плотную питательную среду в чашки Петри методом Коха или Дригальского, причем количество параллельно засеваемых чашек должно быть не менее двух.

При пересеве методом Коха из пробирки с соответствующим разведением стерильной пипеткой набирают 1,0 мл инокулята и выливают на дно пустой стерильной чашки Петри и заливают ее 15-20 мл расплавленным питательным агаром, остуженным до температуры 40°С-45°С. Не поднимая чашки от стола, плавными круговыми движениями перемешивают исследуемый материал со средой, закрывают крышкой и оставляют до застывания среды. После застывания среды чашку переворачивают кверху дном и термостатируют при оптимальной температуре.

При посеве методом Дригальского расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри и оставляют на ровной поверхности для застывания. Застывшую питательную среду подсушивают, а затем в чашку вносят 0,1 - 0,2 мл инокулята и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды.

Засеянные чашки Петри термостатируют при температуре, оптимальной для исследуемых микроорганизмов и через определенное время проводят подсчет выросших колоний. Для подсчета берут то разведение, при котором в чашке выросло от 100 до 300 колоний, хорошо отделенных друг от друга.

Подсчет выросших колоний проводят, не открывая чашки Петри, перевернув их кверху дном. Каждую отсчитанную колонию отмечают точкой с помощью стеклографа или перовой авторучки. Для оптимизации процесса счета колоний используют прибор для счета колоний, который снабжен осветительным устройством, лупой, светофильтрами, сеткой на круглом стекле, перовой ручкой и счетчиком.

Среднее число колоний, образуемых на чашках с агаром, почти всегда пропорционально числу бактерий в инокулуме, т.е. одна единица бактерий образует одну колонию. Но в некоторых случаях (негомогенное распределение клеток микроорганизмов, слипание микроорганизмов, прилипание к стеклу, явление антагонизма и др.) число колоний может быть иным, нежели содержание бактерий в инокулуме. Поэтому принято говорить не о числе микроорганизмов в инокулуме, а о количестве колонии образующих единиц (КОЕ). Этот термин является официальным и употребляется в нормативных документах, определяющих методики микробиологических исследований и допустимые значения присутствия микроорганизмов в объектах окружающей среды.

Зная степень серийного разведения и количество выросших колоний, подсчитывают количество КОЕ в 1 мл исходного инокулята по формуле:

,

где N - КОЕ в 1 мл исходного инокулята;

R - разведение, из которого сделан высев;

М - среднее количество КОЕ, выросших на чашке Петри в разведении R;

V - объем инокулята, взятого для посева в чашку Петри из разведения R.

Например, если при посеве 1 мл инокулята из разведения 1:10⁴ выросло 115 колоний, то КОЕ в 1 мл исходного инокулята будет равно: 115 х 10000:1 = 1150000 КОЕ J

Количество микроорганизмов методом серийных разведений можно определить и посевом на жидкие питательные среды. Этот метод носит название «метод наиболее вероятных чисел» (НВЧ).

Суть метода заключается в подготовке ряда последователь­ных разведений суспензии микроорганизмов, после чего определенным объемом каждого разведения засевают ряд пробирок с мясо-пептонным бульоном. После инкубации учитывают число пробирок с прозрачным и мутным бульоном. Принято считать, что в прозрачном бульоне отсутствуют жизнеспособные клетки микроорганизмов, а каждая жизнеспособная клетка способна вызвать помутнение бульона. Поэтому число жизнеспособных бактерий в исходном инокулуме рассчитывают, исходя из комбинации прозрачных и помутневших пробирок. Величину наиболее вероятного числа клеток определяют по табл. 5.

Входными параметрами таблицы являются числа мутных пробирок в трех группах, зараженными равными по объему инокулумами трех последовательных разведений. Соответствующая величина НВЧ представляет собою среднее число жизнеспособных клеток, приходящееся на первый инокулум, взятый из выбранной группы разведений.

Таблица 5

Величины НВЧ для случаев, при которых суспензиями трех последовательных

10 кратных разведений заражают по 5 пробирок

Число мутных пробирок в группах, зараженных суспензиями трех последовательных разведений	НВЧ первого из взятой группы разведений	Число мутных пробирок в группах, зараженных суспензиями трех последовательных разведений	НВЧ первого из взятой группы разведений
			0,18				3,1
			0,20				3,3
			0,40				4,6
			0,45				4,9
			0,68				7,0
			0,68				9,5
			0,93				7,9
			0,78				11,0
			1,1				14,0
			1,1				13,0
			1,4				17,0
			1,3				22,0
			1,7				28,0
			1,7				24,0
			2,1				35,0
			2,2				54,0
			2,6				92,0
			2,7				160,0
			2,3

Например, пробирки заражали инокулами из разведении 10^-3, 10^-4, 10^-5. Пусть числа мутных пробирок будут 3,1 и 0. По таблице находим, что НВЧ инокулума, взятого из разведения 10^-3, равно 1,1. Тогда в исходной суспензии наиболее вероятное число микроорга­низмов будет соответствовать: 1,1 х 10³ = 1100.

Существуют и другие таблицы, рассчитанные для числа про­бирок на каждое разведение 8 или 10. Чем больше пробирок используется на посев инокулума из одного разведения, тем более точным является НВЧ жизнеспособных клеток.