Выращивание и выделение чистых культур микробов-анаэробов

Для выращивания анаэробов используются обычные питательные среды. Единственным отличием этих питательных сред является пониженное содержание свободного кислорода. Такие условия должны быть созданы не только в питательной среде, но и в воздушном пространстве над ней. Анаэробные условия достигаются физическими, химическими и биологическими методами.

Физические методы основаны на создании вакуумных условий выращивания микроорганизмов. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательной средой кипятят в водяной бане в течение 15-25 минут. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипяченую питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Сразу после посева на поверхность питательной среды наливают слой парафинового или вазелинового стерильного масла толщиной 1-1,5 см, чтобы предохранить посев от насыщения кислородом.

В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Довольно распространенным в микробиологической практике является способ Виньяль - Вейона, основанный на культивировании микроорганизмов в высоких столбиках полужидкого (0,2% - 0,5%) агара с небольшим содержанием глюкозы и муравьинокислого натрия. Для получения столбиков засеянный агар засасывают в пастеровские пипетки, нижний конец которых запаивают. Пипетки помещают в пробирку, закрывают ватной пробкой и ставят в термостат. Через 2-3 суток в столбике запаянного агара вырастают изолированные колонии анаэробов, которые извлекают, надрезая трубку напильником.

Бескислородные условия можно создать в условиях вакуума. Для этого применяют специальные приборы (анаэростаты) или эксикаторы. Воздух откачивают с помощью вакуум-насоса и степень его разрежения контролируют по показаниям вакуумметра.. Иногда воздух в них заменяют углекислым газом, аргоном или азотом.

Химический метод основан на поглощении кислорода специальными химическими поглотителями (гидросульфитом натрия или пирогаллолом). Чаще всего используют метод Аристовского который заключается в том, что чашки Петри, засеянные анаэробами, помещают в эксикатор, на дне которого находится химический поглотитель. Эксикатор закрывают крышкой, края которой смазаны вазелином, и помещают в термостат. Выращивание продолжается 24-48 часов при оптимальной для данного микроорганизма температуре.

В качестве химических поглотителей могут быть использованы редуцирующие вещества (глюкоза, аскорбиновая, пировиноградная и тиогликолевая кислоты, муравьинокислый натрий, индигосер-нокислый натрий, цистеин, гликокол, глютатион). Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление среды Китта-Тароцци, широко применяемой для выращивания анаэробов. В ее состав входят сахарный мясо-пептонный бульон, который наливают в пробирки по 10 мл, и кусочки вареной печени. Перед употреблением среду кипятят для удаления растворенного кислорода, быстро охлаждают, засевают микроорганизмами и заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов наблюдается через 48 и более часов.

Биологический способ выращивания анаэробов заключается в совместном культивировании аэробных и анаэробных микроорганизмов в герметически закупоренных чашках Петри. Для этого в чашку Петри наливают толстым слоем 5% кровяной агар с 2% глюкозы. После застывания агара его делят - разрезают по диаметру канавкой шириной 1,5 см. На одной половине питательной среды засевают культуру анаэробов, поглощающих кислород (кишечную палочку, палочку чудесной крови), а на другой – культуру аэробов. Чашку закрывают, герметизируют парафином, пластилином или скотчем, переворачивают кверху дном и термостатируют. В начале совместного культивирования быстрорастущие аэробы поглощают кислород, создавая благоприятные условия для роста анаэробов.