Выделение чистой культуры микроорганизмов

Для того, чтобы провести исследование определенного вида микроорганизмов, необходимо получить его чистую культуру. Чистая культура представляет собой микроорганизмы, полученные из одной или нескольких клеток в результате посева и культивирования на питательной среде. Материалом для посева являются культуры бактерий, пересеваемые с жидких и плотных питательных сред.

Выделение чистой культуры является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, купьтуральных и биохимических признаков, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

В основе выделения чистых культур микроорганизмов лежит получение накопительных культур, в которых преобладают представители одного вида. Для этого широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. При этом в питательной среде могут отсутствовать жизненно важные компоненты, которые определенные виды микроорганизмов могут фиксировать из окружающей среды. Например, бактерии, фиксирующие азот из атмосферы, выращивают на минеральной спел не содержащей связанного азота; бактерии, разрушающие клетчатку, культивируют в аэробных условиях на средах с клетчаткой.

В других случаях в питательную среду вводят ингибирующие вещества, замедляющие рост чувствительных к ним микроорга­низмов. Например, кишечную палочку культивируют на среде Эндо содержащую фуксин, а молочно-кислые бактерии - на среде с азидом натрия. Для кишечной палочки на среде Эндо и для молочно-кислых бактерий на среде с азидом натрия создаются элективные условия, тогда как рост других микроорганизмов подавлен.

Кроме того, для выделения чистой культуры используют индивидуальную чувствительность микробов к тому или иному фактору внешней среды. Этим способом производится выделение споровых форм микроорганизмов, устойчивых к действию высокой тем­пературы; капсулообразующих бактерий, устойчивых к действию концентрированных растворов минеральных кислот.

Из накопительной культуры получают чистую культуру микроорганизмов определенного вида. Процесс выделения чистой культуры микроорганизмов включает в себя посев, пересев, культивирование и собственно выделение чистой культуры. Для этого предложено много различных методов. Целью каждого из них является получение изолированных колоний на поверхности или в глубине плотной питательной среды. Наибольшее распространение в микробиологической практике получили следующие способы:

- выделение чистой культуры по способу Дригальского;

- посев на поверхность плотной питательной среды петлей штрихами;

- выделение чистой культуры по способу Коха.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, явля­ется наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Посев на поверхность плотной питательной среды про­изводят стеклянным или металлическим (из нержавеющей стали) шпателем определенной формы (рис. 36). Вместо шпателя можно пользоваться стерильным тампоном.

Рис. 36. Шпатели Дригальского из стекла или нержавеющей стали

Перед работой расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри и оставляют на ровной поверхности для застывания. Застывшую питательную среду обязательно подсушивают в термостате при 30 - 37ºС в течение 16-18 часов, так как избыток влаги способствует сливающемуся росту микроорганизмов. Кроме того, предварительное термостатирование позволяет подтвердить стерильность питательной среды, что очень важно для подтверждения чистоты выделяемой бактериальной культуры.

В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя, последовательно втирают оставшийся на нем материал в поверхность питательных сред во второй и третьей чашках Петри. Таким образом, в каждую последующую чашку попадает меньшее количество микроорганизмов, что позволяет получить изолированные колонии. Чашки помещают в термостат, перевернув вверх дном, чтобы образующийся конденсат не размывал рост бактериальной культуры.

Наибольшее число колоний вырастает на первой чашке, в то время как в последней получают изолированные колонии. Эти колонии просматривают под стереомикроскопом и изучают морфологические свойства. Из наиболее типичных колоний готовят мазок и микроскопируют, При наличии в колонии микроорганизмов с характерными морфологическими и тинкториальными свойствами из нее делают пересев в пробирки с мясопептонным бульоном или питательным агаром для получения чистой культуры микроорганизмов одного вида.

Посев на поверхность плотвой питательной среды петлей штрихами. После подсушивания питательной среды чашку Петри переворачивают кверху дном и стеклографом делят его на четыре равные части. Затем чашку возвращают в исходное положение, приоткрывают крышку и без нажима, чтобы не повредить питательную среду, диском петли плашмя распределяют материал на питательной среде параллельными штрихами внутри одного из секторов. Затем, повернув чашку на 90°, той же петлей проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. Таким образом, засевают оставшиеся сектора. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу. При таком способе посева материал, содержащийся на петле расходуется постепенно, истощается, и по линиям штриха, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выделение чистой культуры по способу Коха. Существуют две разновидности этого способа: серийное разведение бактериальной культуры в питательной среде и серийное разведение бактериальной культуры в физиологическом растворе.

В первом случае три пробирки, содержащие по 15 мл питательного агара, ставят в водяную баню для расплавления. Расплавленную среду остужают до температуры 43°С - 45°С. В первую пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1-й пробирки переносят во вторую и таким же образом из второй в третью. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответству­ющими номерам пробирок.

Во втором случае вместо пробирок с питательным агаром используют пробирки со стерильным физиологическим раствором. В первую пробирку пипеткой вносят отмеренное количество бактериальной суспензии и после перемешивания другой пипеткой во вторую пробирку вносят такое же количество суспензии. Затем также засевают третью, четвертую и другие последующие пробирки. Количество пробирок подбирают, исходя из степени мутности первоначальной бактериальной суспензии таким образом, чтобы при посеве суспензии из последней пробирки на плотной питательной среде вырастали единичные изолированные колонии.

После приготовления разведений 0,1 -1,0 мл микробной взвеси стерильной пипеткой выливают на дно пустой стерильной чашки Петри и заливают чашку 15-20 мл расплавленного питательного агара, остуженного до температуры 40°С - 45°С. Не поднимая чашки от стола, плавными круговыми движениями перемешивают исследуемый материал со средой, закрывают крышкой и оставляют до застывания среды. После застывания среды чашку переворачивают кверху дном и термостатируют при оптимальной температуре.