Методы специфической аллергодиагностики ПБА

Провокационную ингаляционную или эндоназальную пробу проводят ис­ключительно в фазу ремиссии БА и только в условиях стационара. Испытание начи­нают с максимального разведения аллергена, исключающего возможность его раз­дражающего действия или влияния запаха. Для ряда промышленных аллергенов по­добраны и испытаны разведения, рекомендуемые для проведения ингаляционного тестирования (табл. 1).

Таблица 1. Концентрации некоторых химических аллергенов, используемые для проведения ингаляционной провокационной пробы.

Химическое соединение	Растворитель	Концентрация раствора
Азотнокислый кобальт	Дистиллированная вода	0,5 - 0,05%
Бихромат калия	------- // --------	0,01-0,001%
Парафенилендиамин	------- // --------	0,001-0,0001%
Формальдегид	------- // --------	0,05-0,01%
Хлористый никель	------- // --------	0,01-0,001%

Начинают исследование с определения на пневмотахометре исходных показа­телей «вдоха и выдоха». Затем в течение 3 - 5 минут больной должен вдыхать пары «тест-контрольной» жидкости («плацебо») и через 15-20 минут следует повторно оп­ределить на пневмотахометре показатели «вдоха и выдоха». При отсутствии сущест­венных различий результатов этих контрольных испытаний проводят ингаляцию па­рами аллергена в течение 2 - 3 минут или эндоназальное его введение в наименьшей концентрации. После завершения пробы в течение 24 часов следят за состоянием больного.

При этом фиксируют данные аускультации и показатели форсированного вдоха и выдоха через 20 минут, 1 час, 2 часа, а учитывая возможность развития замедлен­ной гиперергической реакции - также через 6 и 24 часа. Проба расценивается как по­ложительная, если показатель форсированного выдоха снижается на 20% по сравне­нию с показателем до проведения исследования, если развивается приступ удушья и/или другие аллергические реакции. Развившийся после проведения провокационной пробы бронхоспазм купируют ингаляцией бронхолитического препарата. При необхо­димости испытания ряда производственных аллергенов в течение суток следует про­водить исследование только с одним аллергеном.

Тест торможения естественной эмиграции лейкоцитов - ТТЕЭЛ осно­ван на эффекте изменения миграции лейкоцитов (в 90% сегментоядерных нейтро-фильных гранулоцитов) в слизистую оболочку полости рта при развитии гиперергиче ской реакции на испытуемый аллерген, вводимый в полость рта в виде разведения на физиологическом растворе 1:100.

Подготовка к проведению тестирования заключается в отмене в течение неде­ли антигистаминных и других лекарственных препаратов, включая стероидные гормо­ны. Исследование выполняют через 1,5-2 часа после еды. Больной в течение 2-х минут ополаскивает рот водой для полного удаления остатков пищи. Спустя 15-20 минут ополаскивает рот 10 мл физиологического раствора и собирает всю жидкость в стаканчик №1 - контрольная порция. Через 15 минут проводит полоскание рта в тече­ние 2-х минут 10 мл разведения испытуемого аллергена и собирает всю жидкость в стаканчик №2 тест экспозиции аплергеном. Повторяет эту процедуру через 15 и 30 минут, ополаскивая рот физиологическим раствором по 10 мл - стаканчики №3 и №4. Промывные воды из 1-го, 3-го и 4-го стаканчика (исключая пробу №2) подвергают микроскопическому исследованию в камере Горяева: подсчитывают число лейкоцитов в 25 больших квадратах камеры для каждой анализируемой порции.

Рассчитывают индекс ТТЕЭЛ для 3-й и 4-й опытных порций по формуле:

Индекс ТТЕЭЛ = [Л_к-ль – Л_опыт] х 100%, где

Л_к-ль - количество лейкоцитов в контрольной порции - стаканчик №1;

Л_опыт - количества лейкоцитов в каждой из опытных порций - стаканчик №3 и №4.

Тест расценивается как положительный при угнетении эмиграции лейкоцитов после экспозиции аллергеном на 30% по сравнению с исходной величиной в кон­трольной пробе. Наряду с эффектом торможения миграции клеток, весьма часто на­блюдается эффект стимуляции миграции лейкоцитов в слизистую ротовой полости у лиц, сенсибилизированных к испытуемому промышленному аллергену. В таких слу­чаях тест расценивается как положительный - расценивается как положительный при увеличении числа клеток на 60% и более по сравнению с исходной величиной в контрольной пробе.

Методы специфической иммунодиагностики ПБА. Экспресс-методом выявления сенсибилизации к производственным аллерге­нам является реакция связывания комплемента - РСК как высоко чувствительный тест выявления в сыворотке крови антигаптенных антител. Рабочие разведения хи­мических аллергенов соответствуют 0,001% на физиологическом растворе. Реакция расценивается как положительная, начиная с титра 1:20 - слабо положительная, тит­ры 1:40 и 1:80 - умеренная. Титры 1:160 и 1:320 - высоко положительная. Еще более высокие титры РСК, соответствующие 1:640 и 1:1280, свидетельствует о токсико-аллергических поражениях и не характерны для ПБА. В случае низкого исходного уровня антигаптенных антител (1:20 - как сомнительный результат), а также для ус­тановления патогенетической роли антигаптенных комплементсвязывающих антител целесообразна повторная постановка РСК через 24 часа поспе проведения провока­ционной аллергологической пробы in vivo с производственным аллергеном. Эффект повышения титра антител, по сравнению с первоначальным исходным уровнем, от­ражает участие антигаптенных антител в патогенезе ПБА.

В иммунодиагностике ПБА не потеряпи актуальность такие методы in vitro, как специфические реакции дегрануляции базофилов крови, в частности, РСПБ, кото­рая позволяет оценить реагирование на производственный апперген базофильных гранулоцитов крови как основных клеток-мишеней при гиперчувствительности немед­ленного типа - ГНТ (1-й атопический тип аллергии).

Определение уровня общего lg Ев тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет диагностировать lg Е-зависимые аллергические реакции, характерные для гиперчувствительности немедленного типа. Уровень общего lg E при неосложненной форме ПБА химического генеза, как правипо, не превышает 600 КЕ/мл; при ПБА, осложненной инфекцией, грибковой сенсибилизацией, вирусной инфекцией и др., кон­центрация общего lg E существенно возрастает, достигая 1000 КЕ/мл и выше.

При ПБА химического генеза повторное определение общего lg E через 24 часа после провокационной аллергологической пробы с производственным аллергеном сопровождается его снижением по сравнению с исходным уровнем - эффектом спе­цифического связывания lg Е-антител за счет их расходования на реализацию иммунного ответа на аллерген. Поскольку повышенный уровень общего lg E определя­ется в основном специфическими lg Е-антителами и в силу высокой чувствительности тест-системы ИФА, данный методический прием наиболее целесообразен при сомни­тельных результатах аллергологического тестирования in vivo.

Определение специфических lg E к химическим (производственным) и/или бактериальным и/или грибковым аллергенам предусматривает предварительную ин­кубацию исследуемой сыворотки крови с соответствующими аллергенами при 37°С в течение 60 минут. Рабочие разведения химических аллергенов, как и для РСК, соот­ветствуют 0,001% на физиологическом растворе. При этом соотношение исследуемой сыворотки и разведения химического аллергена при постановке ИФА составляет 1:1. В качестве бактериальных антигенов используют соответствующие аллергены для тестирования человека без их предварительного разведения, добавляя их в иссле­дуемую сыворотку крови в соотношении 1:1. Грибковые аллергены, предназначенные для аллергологического тестирования человека, требуют значительного разведения физиологическим раствором (от 1:10 до 1:50), чтоустанавливается эмпирически - в контрольных анализах с сыворотками крови здоровых лиц. При проведении анализа параллельную контрольную пробу сыворотки крови обследуемого больного разводят физиологическим раствором (1:1) и инкубируют одновременно с опытными пробами, в которые добавляют испытуемые аллергены.

После инкубации во всех пробах определяют количество lg E в тест-системе ИФА, включая:

1 – проба цельной (неразведенной) испытуемой сыворотки крови - определе­ние общего lg E;

2 – проба сыворотки, разведенная физиологическим раствором 1:1 - контроль количества общего lg E в разведенной сыворотке крови по отношению к опытным пробам с аллергенами;

3, 4 и т.д. - опытные пробы с соответствующими аллергенами.

Отношение количества lg E в каждой опытной пробе (с соответствующим ал­лергеном) к контрольной пробе (разведение физиологическим раствором 1:1) позво­ляет судить об эффекте специфического связывания (коэффициент менее 0,90) или диссоциации (коэффициент более 0,10) специфических lg E (аналогично эффектам торможения и стимуляции ТТЕЭЛ).

Эффект связывания специфических lg E - коэффициент 0,9 и ниже - свиде­тельствует об их участии в развитии ГНТ.

Эффект диссоциации специфических lg E - коэффициент 1,10 и выше-сви­детельствует о наличии сенсибилизации к соответствующему аллергену.

При параллельном определении специфических lg Е-антител к несколькими производственным аллергенам, бактериальным и грибковым антигенам величина ко­эффициента позволяет сопоставить уровни соответствующих специфических lg E, оценить их роль в патогенезе бронхиальной астмы и выявить ведущий патогенетиче­ски значимый аллерген.