Пояснення до завдання. Цитогенетичний метод

Цитогенетичний метод

Цитогенетичний аналіз дозволяє записувати діагноз спадкового захворювання у вигляді каріотипічної формули.

Цитогенетичний метод (метод хромосомного аналізу) ґрунтується на мікроскопічному дослідженні структури й кількості хромосом. Він набув широкого застосування в 20-х роках ХХ ст., коли було отримано перші відомості про кількість хромосом у людини. У 30-х роках були ідентифіковані перші 10 пар хромосом.

У 1956 р. шведські вчені Дж.Тийо і А.Леван вперше довели, що в людини 46, а не 48 хромосом.

Цитогенетичний метод використовують для:

· вивчення каріотипів організмів;

· уточнення числа хромосомних наборів, кількості й морфології хромосом для діагностики хромосомних хвороб;

· складання карт хромосом;

· для вивчення геномного і хромосомного мутаційного процесу;

· вивчення хромосомного поліморфізму в людських популяціях.

Хромосомний набір людини містить велику кількість хромосом, основні відомості про які можна отримати при вивченні їх у метафазі мітозу і профазі – метафазі мейозу. Клітини людини для прямого хромосомного аналізу отримують шляхом біопсії кісткового мозку і гонад або непрямим методом – шляхом культивування клітин периферичної крові (лімфоцити), коли отримують значну кількість метафаз. Непрямим методом досліджують також клітини амніотичної рідини або фібробласти, отримані при амніоцентезі або біопсії хоріона, клітини абортусів, мертвонароджених та ін.

Частіше досліджують хромосоми в лімфоцитах периферичної крові з венозної, гепаринізованої крові (10 мл) через 1 год відстоювання в холодильнику, відсмоктують плазму, а лейкоцити розміщують у живильне середовище 199 або Ігла у співвідношенні 1:1,5. Для стимуляції мітозу додають фітогемаглютинін з розрахунку 0,1 мл на 10 см³ суміші, а також пеніцилін – 100 ОД на 1 см³ суміші. Культуру у флаконах поміщають у термостат при 37˚С на 48 або 72 год. За 6 год до кінця інкубації додають колхіцин з розрахунку 0,5 мкг/мл, який перериває поділ лімфоцитів на стадії метафази. Потім культуру знову поміщають у термостат на 2-4 год, після чого її зливають у центрифужні пробірки і центрифугують 5 хв при 800-1000 об/хв. Після центрифугування надосадову рідину зливають, а до осаду додають 5 мл 0,95%-ного розчину цитрату натрію або 0,56%-ний розчин калій хлориду підігрітими до 37˚С. У цьому розчині клітини витримують 7 хв, коли застосовують калій хлорид, або 15 хв, якщо застосують цитрат натрію. Культуру знову центрифугують 5-7 хв за тої ж швидкості обертів. Перебування культури в гіпотонічному розчині й наступне центрифугування призводить до розриву ядерних оболонок і виходу хромосом у цитоплазму клітин.

Після центрифугування надосадову рідину зливають, а до осаду доливають 1-2 мл фіксатора, який складається з метилового (або етилового) спирту й льодяної оцтової кислоти в співвідношенні 3:1. Фіксацію проводять не менше 40 хвилин. За цей час фіксатор декілька разів зливають і додають свіжий (3-4 рази), поки клітинна суспензія не стане безбарвною. В останній порції фіксатора клітини суспензують і 3-4 краплі клітинної суспензії наносять на підготовлене предметне скельце. Висушують феном у струмені повітря і забарвлюють ядерними барвниками: 2%-ним розчином ацеторсеїну, азуреозином, барвником Унна, розчином Гімзи та ін. Накривають покривним скельцем, видаляють надлишок барвника фільтрувальним папером, розглядають під мікроскопом з імерсією.

Останнім часом всі дослідження в цитогенетиці людини проводять із застосуванням методів диференційного забарвлення хромосом (нові методики забарвлення хромосом), які дозволяють відрізнити кожну хромосомну пару. Існує декілька способів забарвлення: Q, G, C, R. У вирішенні питань діагностики хромосомних хвороб різні методи диференційного забарвлення застосовують у комбінації.

Завдяки диференційному забарвленню хромосом можна виявити незначні хромосомні зміни: невеликі делеції, транслокації та ін.

Хромосомні зміни виявляють, досліджуючи каріотип дорослого організму, у клітинах амніотичної рідини та в клітинах хоріона для діагностики хромосомних захворювань плода.

Методика вивчення каріотипу людини, складання каріограми

Отримавши мікропрепарат із культури лімфоцитів периферичної крові, із клітин амніотичної рідини або клітин хоріона вивчають його візуально. Відбирають у полі зору метафазу з роздільно розміщеними хромосомами, а потім мікропрепарат фотографують. З негатива роблять відбитки на фотопапері. З мікрофотографії вирізають зображення кожної хромосоми ножицями, наклеюють їх гумовим клеєм на білий аркуш паперу в ряд, починаючи від найбільшої першої пари, закінчуючи малими хромосомами 21-ї, 22-ї пар і статевої Y-хромосоми. Так отримують ідіограму.

Побудову каріотипу, тобто впорядковане розміщення кожної пари хромосом за індивідуальними ознаками відмінностей: загальна довжина хромосоми, форма, розташування центромери.

Більшість хромосом за такого методу можна тільки віднести до певних груп згідно з денверською класифікацією.

Денверська класифікація хромосом

Група	Номер за каріотипом	Характеристика хромосом
А	1-3	1 і 3 метацентричні, 2 – субметацентрична, великі
В	4-5	Великі субметацентричні
С	6-12, Х	Середні субметацентричні
D	13-15	Середні акроцентричні
Е	16-18	Дрібні субметацентричні, 18- акроцентрична
F	19-20	Найдрібніші метацентричні
G	21-22, Y	Найдрібніші акроцентричні

Цей метод дозволяє діагностувати багато спадкових хвороб, вивчати мутаційний процес, складні перебудови і найменші хромосомні аномалії в клітинах, які вступили у фазу поділу та поза поділом.

На хромосомний аналіз направляються:

· пацієнти з множинними уродженими вадами розвитку;

· діти із затримкою фізичного та психомоторного розвитку;

· пацієнти з недиференційованими формами олігофренії (недоумства);

· пацієнти з порушенням статевого диференціювання;

· жінки з порушенням менструального циклу (первинна або вторинна аменорея);

· сім’ї з безпліддям;

· жінки із звичним невиношуванням вагітності (викидні, мертвонароджені).

Метод вивчення статевого хроматину

Поряд з вивченням мітотичних хромосом певного діагностичного значення набуває спостереження інтерфазних клітин. Відмінною ознакою жіночої статі є вміст в інтерфазних ядрах статевого хроматину або тілець Барра.

У 1949 р. Барр і Бертрам при вивченні нервових клітин кішки виявили в ядрах невеличке інтенсивно забарвлене тільце, якому дали назву “сателіт ядра”. Пізніше було доведено, що воно міститься тільки в ядрах клітин самок і його можна розглядати як ознаку, що відрізняє клітини самок від клітин самців. Це тільце отримало назву статевий хроматин або тільце Барра.

Статевий хроматин міститься тільки в ядрах клітин самок тварин, які мають Х-хромосоми. Після забарвлення ця грудочка хроматину розташована поблизу ядерця, біля ядерної оболонки або лежить вільно в каріоплазмі. Локалізація статевого хроматину всередині ядра відносно постійна для клітин певного типу тканин.

Встановлено, що статевий хроматин є не що інше, як одна із Х-хромосом, яка під час інтерфази перебуває в гетеропікнотичному стані. На стадії бластоцисти одна із Х-хромосом, материнського або батьківського походження, інактивується.

Хід визначення статевого хроматину в людини.

6. Стерильним шпателем отримують зішкріб із слизової оболонки порожнини рота (із внутрішньої поверхні щоки).

7. Зскрібок (білуватий наліт) розміщують як можна рівніше посередині предметного скельця.

8. Мазок для фіксації занурюють у 96%-ний етанол.

9. Через 15-20 хв мазок виймають і підсушують на повітрі.

10. На мазок наносять 1-2 краплі розчину ацеторсеїну. Накривають покривним скельцем і препарат мікроскопують. Спочатку на малому збільшенні, а потім під олійною імерсією. Доліджують тільки інтерфазні добре помітні овальної форми ядра.