ДНК-аналіз

У 1990 р. молекулярно-генетичні лабораторії США, Західної Європи, Росії і Японії приступили до здійснення Міжнародної програми «Геном людини».

Програма включала три напрямки:

1) картування генів людини і з'ясування нуклеотидної послідовності людського генома.

2) структурно-функціональне вивчення генома.

3) медичну генетику і генотерапію.

Для вирішення головного завдання цієї програми – з'ясування нуклеотидної послідовності людського генома – використовують методи секвенування ДНК. Це складна методика, що дозволяє розшифрувати послідовність нуклеотидів ДНК. Передбачалося, що секвенування всього генома буде здійснено до 2005-го року. Однак завдяки технічним удосконаленням цього процесу в даний час структура ДНК людини розшифрована практично цілком.

Крім великого теоретичного значення для подальшого розвитку фундаментальних наук, розшифровка будови ДНК людини важлива для розуміння патогенезу, запобігання спадковим хворобам і їх лікування дозволяє досліджувати молекулярні механізми моногенних захворювань, сприяє розшифровці генетичних основ мультифакторіальних захворювань і спадкової схильності до таких широко розповсюджених захворювань, як атеросклероз, ішемічна хвороба серця, психічні й онкологічні захворювання.

Розшифровка будови генів, відповідальних за спадкові захворювання, створює передумови для їхньої діагностики і генотерапії.

Понад 30 років під керівництвом Віктора Мак-Кьюсіка, професора університету Джона Хопкінса в Балтиморі, збирають інформацію про всі картовані гени людини і зв'язані з ними спадкові захворювання.

«Менделівське успадкування в людини: каталог людських генів і генетичних хвороб» — так називається енциклопедія, що видає В. Мак-Кьюсік кожні два роки. Усі локуси мають у каталозі шестизначний міжнародний номер (MYM). Перша цифра означає тип успадкування:

1. – АД (автосомно-домінантний).

2. – АР (автосомно-рецесивний).

3 і 4. – Гени, зчеплені з Х- і Y-хромосомами (зчеплений зі статтю тип успадкування: ХР-зчеплений з Х-хромосомою рецесивний, ХД-зчеплений з Х-хромосомою домінантний).

5. – Мітохондріальні хвороби.

У 1994 році в енциклопедії Мак-Кьюсіка (11-те видання) було описано 6678 картованих локусів, з них:

– 4458 генів АД;

– 1730 – АР;

– 412 – зчеплені з Х-хромосомою;

– 19 – зчеплені з Y-хромосомою;

– 59 – мітохондріальною ДНК.

Для 2800 генів визначена функція. З них 770 локусів були пов'язані з моногенними захворюваннями, більшість генів клоновані. Клонування гена дозволяє одержати велику кількість його копій, що необхідно для діагностики і генотерапії.

Молекулярно-генетичні методи (методи ДНК-діагностики) – це велика і різноманітна група методів, призначена для виявлення варіацій у структурі досліджуваної ділянки ДНК. ДНК-методи використовуються в наступних напрямках:

1. Для діагностики моногенних і мультифакторіальних спадкових хвороб.

2. Для пренатальної діагностики моногенних хвороб чи статі плода (у випадках Х-зчепленого успадкування).

3. У судовій медицині для ідентифікації особи (геномна дактилоскопія) і встановлення родинних зв’язків.

4. Для діагностики інфекційних захворювань.

5. Для діагностики онкологічних захворювань.

Можливості діагностики пов'язані зі здійсненням програми «Геном людини».

Існує перелік моногенних хвороб, які діагностуються молеку­лярними методами, і доступні пренатальній діагностиці: муковісцидоз, м'язова дистрофія Дюшена-Беккера, гемофілія (А і В), фенілкетонурія, хвороба Хантера (мукополісахаридоз), адрено-генітальний синдром, хорея Гентінгтона, синдром фрагільної Х-хромосоми тощо.

У 1993 році таких захворювань було 130, у 1994 році – 600, у даний час – ще більше. Зараз можлива діагностика будь-якого спадкового захворювання, ген якого картований і доступний прямій або непрямій діагностиці.

У перспективі буде можливо говорити про «генетичний паспорт новонароджених», тобто про те, що після народження за допомогою автоматизованої системи удасться проаналізувати весь спектр найбільш розповсюджених захворювань як моногенних, так і мультифакторіальних.

Молекулярно-генетичні методи можна розділити на прямі і непрямі.

Пряма діагностика проводиться в тих випадках, коли будова гена уже вивчена. Вона включає секвенування ДНК, реєстрацію зміни електрофоретичної рухливості мутантних молекул ДНК, трансляцію білкового продукту in vitro та ін. Непряме виявлення мутацій застосовується в тих випадках, коли будова гена невідома і водночас є інформація про інші структури, що знаходяться поруч з геном — визначення поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів та ін.

Секвенування ДНК — це найбільш точний метод, тому що дозволяє визначити будову гена і виявити будь-яку мутацію. Методики секвенування дуже трудомісткі, вимагають значних витрат матеріалів і часу, у зв'язку з чим не знайшли широкого застосування у клінічній генетиці, а використовується, головним чином, для розшифровки геному людини. З відкриттям на початку 70-х років рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз) – ферментів, здатних розрізати нитки ДНК у чітко визначених ділянках – сайтах рестрикції, дослідники одержали можливість виділяти більш дрібні й у той же час стабільні по довжині й легше ідентифіковані фрагменти.

Визначення поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ) (RFLP – restriction fragments length polymorphism) один з розповсюджених методів ДНК-діагностики. Принцип методу полягає в тому, що виділена ДНК обробляється ферментами, які «розрізають» її на фрагменти в чітко визначених ділянках (сайтах рестрикції). Патологічні мутації можуть змінювати сайти рестрикції, що призводить до зміни довжини отриманих фрагментів.

Трохи пізніше широкий розвиток одержали різні способи вивчення послідовностей ДНК за допомогою олігонуклеотидних зондів — штучно синтезованих коротких ланцюгів нуклеотидів, мічених радіоактивними мітками. За певних умов зазначені зонди можуть специфічно зв'язуватися (гібридизуватися) з комплементарними послідовностями в аналізованій ДНК, що вказує на присутність потрібного фрагмента.

Виділення ДНК для дослідження зазначеними методами являє собою досить трудомістку процедуру. По-перше, ДНК у клітинах міститься у відносно невеликих кількостях у порівнянні з іншими речовинами, тому для одержання очищених препаратів потрібні складні і дорогі методи. По-друге, молекули ДНК, особливо еукаріот, мають значну довжину і являють собою дуже тендітний ланцюг, що при різних біохімічних маніпуляціях виявляється так чи інакше ушкодженим.

Для виділення ДНК отриманий біологічний матеріал обробляють протеолітичними ферментами, щоб видалити усі білки. ДНК адсорбують на пористих носіях або екстрагують органічними розчинниками, після чого проводять багаторазове очищення. При цьому одержують усю ДНК клітин (геномну ДНК).

Дослідника звичайно цікавить тільки визначена, специфічна ділянка ДНК, що важко ідентифікується серед безліч інших, у тому числі нетранскрибуючих ДНК-послідовностей. Це завдання вирішувалося за допомогою трудомісткого підходу: шляхом клонування фрагментів ДНК (тобто розмноження) у різних організмах (так званих векторах), найчастіше у фагах (вірусах бактерій) чи в позахромосомних спадкових одиницях – плазмідах. При цьому фрагмент молекули ДНК якого-небудь організму спочатку вбудовувався в геном фага або в кільцеву ДНК плазміди за допомогою спеціальних ферментів – рестриктаз, нуклеаз, полімераз і лігаз, після чого відбувалося зараження бактерій фагом (трансдукція) або внесення плазмідної ДНК у цитоплазму мікроорганізму (трансформація). Розмноження бактерій веде до нагромадження досить великих кількостей фрагментів ДНК.

Однак процедури молекулярного клонування дуже трудомісткі, вимагають роботи з радіоактивними речовинами, високого ступеня очищення ДНК, тому вони практично не вийшли за межі великих спеціалізованих лабораторій, хоча необхідність дослідження ДНК на рівні нуклеотидних послідовностей давно стала потребою практичної охорони здоров'я.

Зазначені труднощі були усунені у зв'язку з відкриттям у 1983 р. американським ученим К.Б. Мюллісом методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що знайшов широке застосування у всіх галузях практичної медицини. Метод ПЛР, за відкриття якого в 1993 р. Кері Мюллісу була присуджена Нобелівська премія з хімії, революціонізував молекулярну генетику й медичну діагностику.

Етапи ДНК-діагностики з використанням полімеразної ланцюгової реакції:

I. Одержання матеріалу для дослідження. Для молекулярно-генетичної діагностики використовують будь-які ядровмісні клітини. Для діагностики спадкового захворювання частіше беруть кров (лейкоцити), рідше змиви з порожнини рота, волосяні фолікули. Для пренатальної діагностики проводять хоріоцентез (одержання ворсинчастої оболонки хоріона), плацентоцентез (одержання тканини плаценти), амніоцентез (одержання амніотичної рідини і виділення з неї клітин), кордоцентез (одержання пуповинної крові). Для судової медицини будь-які тканини (плями крові, шкіра, сперма та ін.), для встановлення родинного зв’язку за допомогою методів геномної дактилоскопії – кров. Для діагностики інфекційних захворювань — зскрібки з піхви, уретри, бронхолегеневі змиви, культури збудників. Для діагностики онкологічних захворювань — червоний кістковий мозок (при лейкозах) та ін.

II. Виділення ДНК. Для дослідження методом ПЛР придатні навіть невеликі фрагменти слабкоочищеної ДНК. Як правило, ДНК із біологічного матеріалу при цьому виділяють методами лізису клітин з наступним очищенням від білкових компонентів.

III. Ампліфікація. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) дозволяє вибірково ампліфікувати (багаторазово редуплікувати) певну ділянку ДНК у мільйони разів. Принцип ПЛР заснований на ампліфікації ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази, що здійснює синтез взаємно комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи з двох олігонуклеотидних праймерів (запалів) – прямого і зворотного. Праймери – це фрагменти ДНК, комплементарні протилежним ланцюгам ДНК у ділянках, що обмежують обрану ділянку ДНК, і орієнтовані 3'-кінцями назустріч один одному в бік тієї послідовності, яку необхідно ампліфікувати. Таким чином, синтез нового ланцюга може йти тільки в одному напрямку, починаючи з 3'-кінця в напрямку зустрічного праймера. Багато в чому процес ампліфікації подібний із редуплікацією ДНК в ядрі клітини. У реакційній суміші повинні бути присутні:

1) матриця — вихідний ланцюг досліджуваної ДНК, за зразком якої і відбувається синтез нових фрагментів.

2) нуклеотиди — "будівельний матеріал" для нарощування знову синтезованих ланцюгів ДНК.

3) фермент ДНК-полімераза, який каталізує процес синтезу ДНК (у даний час використовується термостабільна полімераза, виділена з бактерій гарячих джерел з оптимумом роботи при температурі 72º С).

4) олігонуклеотидні праймери.

Проведення реакції здійснюється в спеціальній буферній суміші з визначеними концентраціями іонів калію, хлору і точним значенням pH.

Суміш ставлять у спеціальний прилад – ампліфікатор. У ньому автоматично відбувається зміна температур, необхідних для реакції. У результаті реакції проходять багаторазова редуплікація ділянки ДНК, яку хочуть виділити. У підсумку число копій ДНК збільшується в мільйони разів.

IV. Електрофорез фрагментів у ДНК у гелі. У гель додають бромистий етидій (фарба, що забарвлює ДНК). Фрагменти ДНК переміщаються на певну відстань. Ділянка гелю, в якому будуть знаходитися фрагменти ДНК, забарвиться фарбою. Одночасно проводять електрофорез контрольних фрагментів.

V. Аналіз отриманих результатів. Ділянки гелю, в яких міститься фрагменти ДНК, будуть давати жовтогаряче світіння при ультрафіолетовому освітленні. Збіг смуг контрольного фрагмента і дослідного дозволять діагностувати наявність потрібного гена. Гель можна фотографувати або його зображення перенести на екран комп'ютера.

Для виявлення й ідентифікації збудника використовується специфічна для кожного виду пар праймерів. За наявності ДНК збудника в досліджуваній пробі відбувається ампліфікація певного фрагмента його ДНК, що згодом може бути виявлено методом електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі.

Ефективність і надійність ПЛР-діагностики захворювань не викликає сумнівів. Сьогодні створені й широко використовуються в практичній діагностиці тест-системи для ідентифікації:

— ВІЛ-інфекції (визнаний еталонним методом);

— гепатитів В, С, D, Е і т.д., у тому числі кількісна діагностика;

— захворювань, що передаються статевим шляхом: хламідіоз, уреаплазмоз, мікоплазмоз, трихомоноз, гарднерельоз, гонорея;

— ТORCH-інфекцій: токсоплазмоз, краснуха, герпес, цитомегаловірус;

— туберкульозу, бронхолегеневих захворювань, а також ряд інших.

Великі можливості відкриває метод ПЛР в онкології, зокрема при діагностиці вірусу папілом, деякі штами якого асоціюються з раком шийки матки й іншими різновидами раку.

У даний час проводиться робота з впровадження ПЛР у діагностику дифтерії, шлунково-кишкових захворювань. Практично за допомогою цього методу може бути виявлений будь-який мікроорганізм або вірус у середовищі.