Применение ПЦР диагностики в гематологии и онкологии

Общеизвестно, что интенсивная цитостатическая терапия наряду с противоопу­холевым эффектом оказывает выраженное иммунодепрессивное действие. В связи с этим у больных необходимо регулярно контролировать наличие системных или локальных инфекций, прежде всего вирусной природы. Так, инфекция цитомегаловирусом или парвовирусом В19 может вызвать выраженное подавление гемопоэза. Вирус Эпштейна-Барр иногда сопутствует возникновению лимфом. Это осо­бенно важно при использовании препаратов, подавляющих иммунитет (например, циклоспорина) после пересадки костного мозга. Кроме того, после многократных трансфузий эритроцитов или тромбоцитов больных нужно периодически прове­рять на наличие вирусов гепатитов В и С в плазме крови.

Злокачественная трансформация клеток вызывается нарушениями в генах, отвечаю­щих за регуляцию их деления, дифференцировки и программированной гибели-апоптоза. Мутации генов - явление случайное, но селективный отбор мутантных клеток делает родоначальниками опухоли только те клетки, которые независимы от регуляторных сигналов организма. Для формирования злокачественности необходимо 6-14 генетических событий, хотя общее число мутаций в опухолевых клетках может состав­лять тысячи. Как правило, вся опухолевая масса является потомками одной клетки, по­этому и мутации передаются всем клеткам-потомкам.

Определение мутантных генов и их РНК продуктов составляет основу молекулярно-ге-нетической диагностики онкологических заболеваний. Молекулярно-генетические мето­ды онкодиагностики высокочувствительны (10^-15-10-¹⁸г). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) мутантных генов в ДНК плазмы крови часто позволяет выявить опухоль в док­линической стадии. Теоретические расчеты показывают, что таким путем может быть обнаружен опухолевый очаг размером до 0,01 см³.

Наибольшую практическую ценность в качестве молекулярно-генетических маркеров име­ют онкогены и антионкогены. Онкогены - дефектные гены факторов положительной регу­ляции клеточного деления (семейства ras, raf и myc-генов, семейства генов ростовых рецеп­торов) и генов антиапоптозных факторов, особенно bcl-2. Антионкогены или гены супрессоры опухолевого роста - гены факторов отрицательной регуляции клеточного деления, или гены факторов апоптоза. Дефект антионкогенов приводит к потере их противоопухолевой функции. Хотя известны десятки генов супрессоров опухолевого роста, наибольшее диагно­стическое значение имеют мутации гена белка р53 — ингибитора клеточного деления и клю­чевого фактора апоптоза, которые встречаются более чем в половине случаев онкологиче­ских заболеваний. Почти столь же распространены в опухолях дефекты гена супрессора опу­холевого роста белка р16. Молекулярно-генетический анализ онкогенов myc, ras, bcl-2 и ан-тионкогенов р53, АРС и р16 позволяет выявить большинство опухолей человека. Ранним и постоянным признаком малигнизации является развитие состояния генетиче­ской нестабильности, что вызывает мутации в микросателлитных ДНК - второй вид мо­лекулярно-генетических онкомаркеров.

Наконец, для опухолей характерно нарушение метилирования ДНК. Поэтому тр. видом молекулярно-генетических маркеров может быть анализ сайтов метилирования в опухолевой ДНК. Наиболее характерно гиперметилирование генов р 16, HIC, 14-3-30, АРС, GSTP1, E-cad, hMLHl, PTEN.

Поскольку опухоли имеют обычно моноклоновую природу, маркерные мутации присут­ствуют во всех опухолевых клетках, что позволяет обнаружить достаточное количество молекул мутантной ДНК при анализе, как самой опухоли, так и лимфатических узлов, крови, костного мозга, содержащих опухолевые клетки. Более того, мутантные молеку­лы ДНК опухолевого происхождения могуг быть выявлены даже в плазме крови онколо­гических больных.

Таким образом, для диагностики опухолей могут быть использованы три вида молеку­лярно-генетических маркеров. Однако, если для анализа онкомаркеров в ткани опухоли достаточно невысокой чувствительности, обнаружение их в лимфоузлах, костном мозге, крови и особенно плазме крови дребует особо высокой чувствительности, которую надежно обеспечивает только ПЦР.