Рестрикційні карти: принципи побудови, сфери завтосування

Рестрикційні карти—схема, на яку нанесено сайти розпізнавання різних рестриктаз, дана лінійна послідовність цих сайтів та відстань між ними в парах нуклеотидів для коротких фрагментів, в тис. пар нуклеотидів для довгих фрагментів.(п. н., т. п. н.)

Створення базується на поліморфній довжині рестрикційних фрагментів ДНК.

Довжину фрагменту визначають електрофорезом в поліамінакриловому гелі. Чим довший фрагмент, тим менший шлях проходить.

При побудові рестрикційних карт є 2 підходи:

• метод декількох рестриктаз
• метод 1 рестриктази, метод неповного гідролізу.

1. Задача: Поділили 2-ма рестриктазами і визначили, що при дії Bgl ІІ—2;11 т. п. н. Eсо R I—5; 8 т. п. н.

Bgl ІІ і Eсо R I—2; 5; 6 т. п. н.

∑=13 т. п. н.

Скласти реструкційну карту.

Фрагмент 13 т. п. н. (5+8; 2+11)

2.Застосовується коли є сайти для дії 1 рестриктази. Проводять гідроліз і електрофорез. Встановили:

А-4; 7 т. п. н.

В-2; 4 т. п. н.

С-5; 7 т. п. н.

Д-2; 4; 7 т. п. н.

Використовується метод перекривання відрізків.

Ці карти потрібні для встановлення розміщення ділянки, яка змутувала. Дозволяє судити про розміри генів, дозволяє встановити, які реструктази необхідно використовувати для вирізання необхідного гена, для з’ясування питань систематики, як рослин так і тварин.

26.Фізичне картування – це група методів, які дозволяють будувати карти геному і визначати відстань між нуклеотидними послідовностями з точністю від кількох тисяч н.п. до однієї нуклеотидної пари.

Основою фізичного картування є побудова фізичних карт.

Фізичні карти (генні) – схеми, які демонструють послідовність нуклеотидів у межах одного або суміжних генів. Для встановлення послідовності були розроблені два методи секвенування: Хімічне (Максама –Гілберта) та метод ферментативного копіювання (Сенджера)

27.Метод Максама-Гілберта або хімічне секвенування- метод секвенування, заснований на специфічних розривах фрагмента ДНК, радіоактивно міченого з одного кінця. Препарат міченої ДНК розділяли на чотири аліквоти і кожну обробляли реагентом, що модифікує одну або дві з чотирьох основ. При взаємодії з хім. реагентом основа пошкоджується, а потім вилучається. Утворюється набір мічених фрагментів, розміром від розриву основи до міченої молекули. Наступний електрофорез у поліакриламідному гелі дозволяє відновити повну структуру досліджуваного фрагменту. Аналіз за допомогою радіографії (для рад. мітки) або за допомогою поточної детекції(для флюор.мітки).

Метод Сенджера- спосіб ферментативного секвенування в основі якого лежить ферментативне копіювання за допомогою фрагмента. Для кожної нормальної основи синтезується ненорм. аналог, він включається в ланцюг і на ньому синтезує обривки.

В методі використовуються:

-1-ланцюгова ДНК;

-короткий праймер(затравка)

-набір нуклеотидів;

-набір природніх аналогів нуклеотидів, що є термінаторами росту ДНК, бо не можуть утвор. фосфодиефірний зв. з наступним нуклеотидом.

-ДНК-полімераза.

. Таким чином, для визначення первинної структури досліджуваного фрагмента ДНК було потрібно провести чотири реакції копіювання: по одному типу термінаторів в кожній з реакцій. Після цього отримані продукти розганяли в поліакриламідному гелі на сусідніх доріжках і по розташуванню смуг визначалася послідовність нуклеотидів. Аналізують комплементарний ланцюг.

28.Вектор – це молекула ДНК, що здатна переносити і стабільно підтримувати в реципієнтних клітинах чужорідну генетичну інформацію.

Вимоги: невеликий вміст ДНК, реплікація за типом послабленого контролю, містить принаймні 2 селективних маркери (Як селективні маркери використовують гени стійкості до антибіотиків.

, має унікальні сайти для рестриктази

У якості векоров використовують плазміди, віруси, фаги, мітохондрії, хлоропласти, дріжджі.

Залежно від завдань, вектори поділяються:

-звичайні, за допомогою яких гени розмножуються в достатній кількості.

-спеціалізовані вектори, які використовуються для експресії генів, для одержання бібліотек генів.

Типи векторів:

- Вектори на основі плазмід

- Вектори на основі бактеріофага λ (вектори- впровадження, вектори-заміщення, косміди, фазміди)

- Вектор на основі фага М13.

- Вектор на основі дріжджів (вектори інтеграції, епісомні вектори, вектори з хромосомними реплікаторними послідовностями)

- Вектори на основі віруса SV40 (трансдукуючі, плзмідні, пасивні трансформуючі)