Основні етапи генно-інженерного досліду

Типовой эксперимент в генной инженерии состоит из следую­щих этапов:

1) получение фрагмента (или смеси фрагментов) ДНК;

Источники ДНК для клонирования. Существует три различных источника молекул ДНК, исполь­зуемых в генной инженерии. Первым, важнейшим из них, явля­ются фрагменты генетического материала различных организмов. Вторым источником могут быть двунитевые дезоксирибонуклеи-новые кислоты, полученные на основе однонитевой ДНК компле­ментарной мРНК эукариотических организмов (дн-кДНК). Третий источник молекул ДНК для клонирования — химиче­ский, вернее, химико-ферментативный синтез генов.

2) конструирование in vitro рекомбинантных молекул ДНК, состоящих из фрагментов, полученных на первом этапе, и небольших автономно реплицирующихся в клетке-реципиенте структур (плазмид, фагов, вирусов), носящих название векторов;

Методы воссоединения фрагментов ДНК.

Наиболее простой и широко применяемый метод соединения фрагментов ДНК — это отжиг фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазой, образующей «липкие» комплементарные однонитевые, концы, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, т. е. восстанавливает ковалентную непрерывность цепей ДНК. Наличие «липких» концов не является обязательным условием для вос­соединения фрагментов ДНК-лигазой. Так, ДНК-лигаза, коди­руемая фагом Т4 (но не лигаза Е. coli), способна соединять и полностью двунитевые фрагменты. Однако, для того чтобы эта реакция протекала эффективно, необходимо наличие высокой концентрации ДНК и значительно большей (приблизительно в 10 раз) концентрации фермента.

Существуют специальные методы воссоединения ДНК, позволяющие направить процесс преимущественно в сто­рону получения гибридных молекул. Один из методов основан на расщеплении ДНК вектора несколькими рестриктазами, с тем чтобы уменьшить вероятность самосборки исходного вектора in vitro. Этот метод используется, когда при рас­щеплении ДНК вектора нужной рестриктазой образуется несколько фрагментов, не все из которых необходимы для обеспе­чения жизнеспособности будущей рекомбинантной молекулы.

Другой эффективный метод, позволяющий предотвратить воссоединение кольцевой векторной молекулы при обработке ДНК-лигазой, заключается в отщеплении концевых фосфатных групп от линейной ДНК под действием щелочной фосфатазы. Образование ДНК^-лигазои кольцевых молекул ДНК in vitro в этом случае возможно только в присутствии фрагментов донорной ДНК, имеющих неповрежденные 5'-фосфатные группы на 5'-концах. В результате создаются гибридные кольцевые моле­кулы с однонитевыми разрывами в комплементарных нитях ДНК, которые репарируются клеткой in vivo. Метод фосфатазной обработки широко используется при воссоединении фрагментов как по липким, так и по тупым концам.

Часто возникает потребность клонирова­ния фрагмента ДНК, полученного расщеплением одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт расщепления для другой рестриктазы. С этой целью широко применяются короткие синтетические двуспиральные олигонуклеотиды, имеющие в своем составе сайты узнавания для одной или нескольких рестриктаз. Такие олиго­нуклеотиды называют линкерами или полилинкерами соответственно.

Еще один метод воссоединения фрагментов основан на свой­стве фермента — терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы — достраивать нуклеотидные последовательности к 3'-ОН-концам фрагментов ДНК (коннекторньй метод). Сущность метода заключается в присоединении к концам одного из соеди­няемых фрагментов ДНК однонитевого полинуклеотида, напри­мер поли A (dA), а к другому — комплементарного ему, напри­мер поли Т (dT). Достроенные таким образом фрагменты сме­шивают и отжигают для образования кольцевых структур. Возможные бреши ликвидируют обработкой экзонуклеазой III, ДНК-полимеразой и лигазой, в результате чего получают ковалентно замкнутые кольцевые молекулы.

Основными достоинствами коннекторного метода являются возможность его применения независимо от природы и способа получения фрагментов ДНК и высокий выход рекомбинантных молекул. Важно, что при таком способе воссоединения фрагмен­тов ДНК не могут образоваться исходные кольцевые векторные молекулы.

К недостаткам метода следует отнести трудности, которые возникают при точном вырезании клонированных фрагментов. Кроме того, протяженные гомополимерные участки могут отри цательно влиять на стабильность плазмид из-за внутримолеку­лярной рекомбинации, а также на экспрессию генов, если она контролируется промотором вектора.

3) введение рекомбинантных молекул ДНК в клетку-рецепиент;

Векторные молекулы. Вектором называется та часть рекомбинантной ДНК, которая обеспечивает ее проникновение и репликацию в клетке-хозяине.

Векторная молекула должна обеспечивать также стабильное наследование гибридных молекул. Для обеспечения интеграции чужеродной ДНК в векторной молекуле необходимо присутствие сайтов расщепления рестриктазами, которые должны локализо­ваться в области, не существенной для репликации векторной молекулы. Наконец, векторная молекула должна нести хотя бы один генетический маркер, позволяющий фенотипически опреде­лить ее присутствие в клетке-хозяине. Любая молекула ДНК, обладающая данными свойствами, может использоваться как вектор.

На самом деле, реальные векторы должны обладать еще це­лым рядом свойств в зависимости от целей их применения. Так, очень важно, чтобы вектор позволял осуществлять вставку чуже­родной ДНК различной молекулярной массы и чтобы свойства вектора давали возможность различать клоны бактерий, несущих исходные векторные и рекомбинактные молекулы. Удобно рабо­тать с небольшими по размеру векторами, которые к тому же дают большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку векторной и рекомбинантной ДНК. Векторная молеку­ла должна иметь как можно больше единичных последователь­ностей, узнаваемых различными рестриктазами, что может обес­печиваться введением полилинкеров. Лучше всего разработана система вектор — хозяин для бактерий Е. coli. В этом случае используется четыре типа векторов: 1) плазмиды; 2) бактерио­фаг Я.; 3) производные бактериофага к (космиды и фазмиды); 4) бактериофаг М13.

4) отбор клонов, несущих нужную рекомбинантную молекулу.

Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные молекулы. В большинстве экспериментов по молекулярному клонирова­нию используется сложная смесь фрагментов ДНК- Существуют специальные приемы, позволяющие отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. Например, при использовании фазмид дают урожай исключительно фаговые корпускулы, в го­ловки которых пакуются рекомбинантные молекулы. При приме­нении плазмид отбирают клоны с рекомбинантными ДНК по инактивации одного из маркеров плазмиды и т. д. Гораздо слож­нее найти среди рекомбинантов клон, несущий нужный исследо­вателю ген.

В том случае, когда ожидается с высокой вероятностью экс­прессия клонированного гена, методы скрининга рекомбинантных клонов основываются либо на изменении фенотипа клетки под влиянием вновь синтезированного белка, либо просто на свой­ствах самого белка.

Например, если необходимо изолировать гены Е. coli, ответственные за биосинтез какой-либо аминокислоты, то отбирают рекомбинантные клоны, трансформируя гибридные плазмиды в ауксотрофные по биосинтезу аминокислот мутанты и получая прототрофные клоны. Это и есть тест на комплемеаитацию. Прием очень удобный, но он используетется при «самоклонировании», т. е. при переносе генов на многокопийных плазмидах в тот же микроорганизм, и требует наличия штаммов с хорошо охарактеризованными мутациями искомых генов.

Если исследователь может получить продукт гена, т. е. бе­лок, то возможен отбор нужного клона иммунологическим мето­дом. Наиболее эффективен метод прямой радиоиммунологической детекции колоний. Для этого колонии клеток, несущие рекомбинантные молекупы, лизируют на поверхности агара, а затем отпе­чатывают на поливиниловую пластинку, на которой адсорбирова­ны антитела. После отмывки диски обрабатывают меченными антителами к белку искомого гена. Таким образом, образует­ся комплекс антигена с двумя молекулами антитела, одна из которых мечена иодом, а вторая присоединена к пластинке. Образование комплекса тестируется радиоавтографически. Ме­тод очень чувствителен и дает положительный ответ при наличии в клетке всего одной или нескольких молекул искомого белка.

В случае отсутствия экспрессии клоны могут быть идентифи­цированы по первичной структуре ДНК или по характеру белка, синтезированного в подходящей системе (ооциты лягушки, бес клеточные экстракты). Тестирование первичной структуры ДНК осуществляется гибридизацией с меченой очищенной мРНК Трудности метода связаны прежде всего со сложностью получе­ния гомогенных препаратов мРНК. Кроме того, клоны, дающие позитивный ответ при гибридизации, не обязательно содержат нужный ген или его часть.

Важной модификацией метода является так называемая гибридизационная селекция. При этом способе денатурируют кло­нированную ДНК, иммобилизуют ее на твердой матрице и гибридизуют с препаратом мРНК Дуплекс ДНК — РНК нагревают для освобождения мРНК, которую затем добавляют в бесклеточные белоксинтезирующие системы или вводят в ооциты лягушки для трансляции. Продукты трансляции идентифицируют или по биологической активности, или иммуноприцепитацией. Последний метод чрезвычайно трудоемок, но позволяет обнаружить в библио­теке клоны, содержащие кДНК, мРНК которых представлена в количестве 0,03—0,01 % от суммарной клеточной мРНК.

Если известна первичная структура гена или кодируемого им белка, или хотя бы их фрагментов, то для скрининга клонов можно использовать синтетические олигонуклеотиды — зонды. Экспериментально установлено, что зонды не должны быть коро­че 14—15 п. о. Лучше брать два зонда одновременно к разным участкам одного и того же гена. В силу вырожденности кода, если известна только аминокислотная последовательность, при­ходится синтезировать набор олигонуклеотидов, из которых один будет полностью комплементарен к искомому гену.