Ферменти, що використовуються в генно-інженерних дослідах

Ферменти - основний інструмент технології рекомбінантних ДНК, поділяються на групи:

1) Ферменти які синтезують фрагменти ДНК на матриці РНК.

2) Ферменти за допомогою яких здійснюється об'єднання фрагментів ДНК.

3) Ферменти, які використовують для одержання фрагментів ДНК.

4) Ферменти, які дозволяють здійснити зміни структури кінців фрагментів ДНК.

5) Ферменти, які застосовуються для приготування гібридизаційних проб.

1) РНК-залежна ДНК-полімераза (зворотна транскриптаза) - фермент класу трансфераз, що здійснює ДНК-ДНК-залежний синтез ДНК і синтез ДНК на матриці РНК (зворотна транскрипція). Ця реакція вимагає затравки (праймера), в якості якого використовується полідезоксиріботімідинова кислота [poly (dT)]. В результаті дії ферменту на матриці РНК із виникненням poly (dT) затравки утвориться комплекс ДНК-ДНК. Далі за допомогою РНК-аз або лужного гідролізу виділяють РНК ланцюг. ДНК, що залишилася, є копією РНК і називається кДНК. кДНК може бути перетворена в 2-ланцюгову ДНК за допомогою РНКази Н або лужного гідролізу (для видалення мРНК), а також ДНК-полімерази I, що каталізує реакцію синтезу комплементарного ланцюга ДНК. Крім того, зворотна транскриптаза сама має активність РНКази Н (тобто руйнує ланцюг РНК, що входить до складу ДНК-РНК-дуплекса). Подібно всім ДНК-полімеразам, зворотна транскриптаза здатна функціонувати тільки при наявності затравки. In vivo зворотна транскриптаза синтезує двуланцюгову ДНК на матриці геномної РНК ретровирусів, підготовляючи її для інтеграції в геном клітини-хазяїна. Зворотна транскриптаза широко використовується в генній інженерії для клонування послідовностей нуклеотидів мРНК еукаріот. Вперше виявлена в 1970.

2) ДНК-лігаза - фермент, що каталізує утворення фосфодиефірних зв'язків між сусідніми нуклеотидами в молекулі ДНК. В технології рекомбінантних ДНК використовуються в основному дві ДНК-лігази: E. coli і Т4. Обидві лігази служать для репарації одноланцюгових розривів у дуплексній молекулі ДНК і для з'єднання двох молекул ДНК шляхом лігування тупих або липких кінців. ДНК-лігаза вперше виділена Б. Вейсом і К. Річардсоном в 1966 р.

Також використовується РНК-лігаза фага Т4. Цей фермент бере участь у синтезі олігорибо- і олігодезоксирібонуклеотидів без виникнення матриці, а також поєднує розриви в ланцюгах ДНК. Також РНК-лігазу використовують для введення радіоактивної мітки в 3’- кінець РНК.

3) Ендонуклеази рестрикції (рестриктази) діляться на три класи:

a) ферменти, які впізнають певну послідовність і розрізають ДНК недалеко від цієї послідовності, але не в специфічній ділянці (I).

b) ферменти, що впізнають певну послідовність і розрізають подвійну спіраль ДНК в строго фіксованому місці всередині цієї послідовності (II).

c) ферменти, що впізнають певну послідовність і розрізають спіраль ДНК, відступаючи певну кількість нуклеотидів від кінця цієї послідовності (III).

Рестриктази II класу є основним інструментом при конструюванні рекомбінантних молекул ДНК і при аналізі структури ДНК.

По способу розрізання рестриктази поділяються на:

· ферменти, що розріжуть зі зміщенням.

· ферменти, що розріжуть точно в сайті рестрикції.

Серед ферментів, які виділені з різних мікроорганізмів, зустрічаються такі, що впізнають на ДНК ті самі послідовності. Ці рестриктази називають ізошизомери. Розрізняють изошизомерію:

· справжню, коли ферменти впізнають ту саму послідовність і ріжуть ДНК в тому самому місці.

· несправжню, ферменти впізнають одну й ту ж послідовність, але ріжуть ДНК в різних точках всередині цього сайту впізнавання.

В 1973р. американські дослідники Сміт і Натанс запропонували номенклатуру для позначення рестриктаз.

Наприклад: Eco RI

1 2 34

1 - родова назва

2 - видова назва E. соlі

3 - особливості штаму

4 - порядок відкриття

Відкриття рестриктаз дало можливість складати рестрикційні карти.

4) До четвертої групи входить велика кількість ферментів. Найбільш широко використовуються декілька груп:

1. Нуклеази, які специфічні у відношенні до одноланцюгових ДНК.

а) ендонуклеази;

До ендонуклеаз відноситься нуклеаза S1 з Aspergilus oryzae.

б) екзонуклеази - найбільше застосовується екзонуклеаза E. соlі ехоVII (ініціює відщіплення як від 5'-, так і від 3’- кінця).

2. Нуклеази, специфічні стосовно 2-ланцюговой ДНК.

а) екзонуклеази фага λ, які відщепляють 5’-кінець. (найпоширеніші)

б) екзонуклеаза ІІІE.Сoli, що відщеплює 3’- кінці.

в) Фосфомоноестераза (фосфатаза). Гідролізує 5’- і 3’-кінцеві фосфомоноефіри в ДНК і РНК.

г) Полінуклеотидкіназа, виділена з E. соlі інфікованої фагом Т4 -добудовує 5’-кінці фосфатною групою. Часто використовується для введення радіоактивної мітки в 5’-кінці ДНК.

д) Термінальна дезоксинуклеотидилтрансфераза (кінцева трансфераза, термінальна трансфераза) добудовує в двуланцюгових ДНК однотипові ділянки з 3’- кінця. Використовується для створення штучних липких кінців, для синтезу специфічних затравок.

є) Поліаденінполімераза (poly А) проявляє активність у відношенні до РНК, приєднує нуклеотидні залишки до 3’-кінця ланцюга без участі матриці. Специфічна у відношенні РНК. Її використовують для приєднання поліаденілових кінців до РНК при синтезі кДНК.