Методи отримання необхідних генів

Метод получения необходимого гена.

1. Химико – ферментативный синтез.

2. С помощью рестриктаз – из природного материала.

3. Синтез генов на матрице РНК с помощью обратной транскрипции.

1-ый метод был впервые осуществлен в 1969 году ученым Хорана (или Корана) в лаборатории – для гена аланиловой тРНК дрожжей. Данный ген имел небольшой размер – всего 77 п. н. Причем синтез проводился не сразу для всего гена, а постепенно для отдельных кусков, которые затем объединялись в одно целое. Однако такой ген был функционально неактивным, поскольку не имел регуляторных элементов.

В 1976 году этот же исследователь синтезировал ген супрессорной тирозиновой тРНК. Протяженность данного гена составляла 126 п. н. + к нему были присоединены:

- промотор;

- терминатор;

- на концах – тетрануклеотид АААА.

На этот раз такой ген с регуляторными элементами был функционально-активным, что доказали исследования. Ген встроили в геном фага с дефектным геном тирозина – вместо тирозина считывалась нонсенс-мутация. После же встраивания этого гена происходила супрессия мутации и фаг восстанавливал свою способность к размножению – что свидетельствует о восстановлении считывания тирозина.

3-ий метод: химический синтез оператора лактозного оперона E. coli. Оператор был искусственно синтезирован в пробирке и встроен в плазмиду. После этого в составе плазмиды он был введен в бактерию. После введения таких таких операторов в микроорганизмы репрессоров уже не хватало, чтобы заблокировать синтез ферментов – начинался активный синтез ферментов, усваивающих лактозу. Полученные результаты продемонстрировали возможность создания генов, идентичных природным генам. Химический метод синтеза в «чистом» виде не используется для синтеза нуклеотидов (или используется, но только для маленьких по размеру). Химический метод используется для создания зондов, линкеров, праймеров, адаптеров и т. д.

Для осуществления химического синтеза обычно используется 2 метода:

1-ый – фосфат 3 эфирный (или фосфо3эфирный);

2-ой – фосфит 3 эфирный (фосфорамидитный) – этот метод является более распространенным.

Однако в любом случае строительным материалом является дезоксирибонуклеозиды; синтез происходит автоматически – в синтезаторе ДНК. Реакция синтеза происходит в камере, в которую специальные насосы загоняют реагенты. Весь процесс регулируется с помощью автоматических программ.

ФОСФОТРИЭФИРНЫЙ СПОСОБ:

1-ое условие синтеза – защитить реакционную группу.

- аминогруппу А защищаем с помощью бензоирования (то есть подвергают действию бензола);

- аминогруппу Г – с помощью изомасляной кислоты;

- 5 - ОН группу защищаем с помощью диметокситретилом.

Таким образом, защитив все реакционно способные группы, мы можем вести синтез в предусматриваемом направлении (то есть так, как мы запланировали). После завершения синтеза, реакционные группы восстанавливают:

- аминогруппы – с помощью щелочного гидролиза;

- гидроксильные группы – с помощью кислотного.

С помощью данного метода мы получаем небольшие ди- и триэфиры, которые мы потом и соединяем между собой.

ФОСФОРАМИДИТНЫЙ МЕТОД:

В настоящее время это наиболее распространенный метод химического синтеза ДНК. Исходными строительными блоками в нем являются модифицированные дезоксирибонуклеозиды.

Каждый нуклеотид, модифицированный определенным образом – фосфорамидит.

Сам процесс синтеза является многоэтапным и включает в себя 4 ступени, которые повторяются n-ое количество до тех пор, пока не будет присоединен последний нуклеотид.

Этапы:- детритиллирование;- активация и присоединение; - кепирование;- окисление.

1-ый нуклеотид фиксируется на твердом носителе (стеклянном шарике) с помощью спейсера, при этом к носителю присоединяется 3 -ОН группа.

2-ой нуклеотид, который вводится в реакционную смесь – его необходимо детритиллировать, для чего используют трихлоруксусную кислоту (ТХУ). При этом ОН – группа детритиллированного нуклеотида остается свободной. Одновременно с этим в реакционную смесь вводят следующий нуклеотид, в котором мы должны освободить «руку» - этот нуклеотид мы активируем с помощью тетразола. Таким образом, эти два основания соединяются между собой через ОН – группу.

Проводят окисление (с помощью йодной смеси) – связь становится стабильней. Дальше все перечисленные операции проводят еще раз.

После завершения синтеза мы проводим кислотный и щелочной гидролиз и получаем готовую последовательность нуклеотидов.

Ферментативный синтез:

В данном методе используют фермент полинуклеотидфосфорилазу, для работы которого не нужна матрица. И хотя при использовании данного фермента скорость реакции невысокая, его все равно продолжают использовать.

Для данного метода кроме вышеназванного фермента нужны:

- праймеры;

- двухвалентные ионы Мg или Mn.

С помощью данного метода мы можем соединять олигонуклеотиды.

Химико-ферментативный метод:

В данном методе сначала синтезируют частично перекрывающиеся между собой фрагменты, которые достраивает между собой ДНК – полимераза и «латает» бреши ДНК - лигаза. В результате мы имеем цельный фрагмент ДНК.

Чтобы осуществить вышеперечисленные способы синтеза генов мы должны знать последовательности нуклеотидов (что ограничивает применение данных методов).

И хотя данный метод на сегодняшний момент утратил свою значимость, именно с его помощью были синтезированы ген проинсулина, оператор E. coli и др.

Синтез генов на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы:

Для проведения данного метода мы должны иметь матрицу, затравки и праймеры и необходимый фермент.

На матрице РНК с помощью обратной транскриптазы достраивается комплементарная ей цепь – кДНК.

Этот метод достаточно распространен: именно с его помощью были синтезированы инсулин, соматотропин и многие др.

«+» данного метода: мы получаем полноценный ген без интронов. Если бы мы получали ген с интронами, то он не смог бы нормально функционировать в микробной клетке, поскольку у прокариотов интронов нет.

«-» метода: достаточно низкий выход – всего 5 % от первоначально заданного количества.

Фрагментация ДНК донорного организма:

- неспецифическое дробление;

- специфическое дробление.

До того, как в 1972 году были открыты рестриктазы, единственным доступным методом являлось неспецифическое дробление – брали ДНК в шприц и многократно повторяли операцию набирания и выпускания смеси с ДНК обратно. В результате таких манипуляций ДНК разрушалось на фрагменты, размер и строение которых никто не мог предусмотреть. С такой ДНК работать ввиду абсолютной непредсказуемости результатов было, конечно, невозможно.

Метод специфического дробления:

его «+»: использование возможно для любых объектов;

его «-»: мы всегда ориентируемся на сайты определенных рестриктаз; не можем использовать для генов эукариот для клонирования в прокариотах.