Основные методы лабораторной диагностики

Приготовление и микроскопирование мазков. Во всех случаях обследований на зараженность простейшими кишечника обязательным является приготовление и изучение нативных мазков и препаратов, окрашенных раствором Люголя. Для этого на предметное стекло на расстоянии 2-4 см друг от друга разными пипетками наносится по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора и раствора Люголя. Деревянной палочкой (одной и той же) готовят гомогенную полупрозрачную взвесь исследуемого материала сначала в капле изотонического раствора, а затем в растворе Люголя. Каждую каплю накрывают чистым покровным стеклом. При наличии в испражнениях патологических примесей (слизь, кровь) их исследуют в мазке с изотоническим раствором. Жидкий прозрачный материал (водянистые испражнения, дуоденальное содержимое) можно исследовать без изотонического раствора, нанося 2 - 3 капли его на предметное стекло и покрыв их покровным стеклом. При исследовании плотного, оформленного кала, в котором могут содержаться только цисты простейших, микроскопируются лишь препараты, окрашенные раствором Люголя. Просматривается вся площадь мазков сначала под малым (8x10), а затем под более сильным увеличением (10х60). В каждом случае нужно промикроскопировать 2 - 3 препарата из разных мест имеющейся пробы. При сомнительных и отрицательных результатах для окончательного заключения требуется произвести не менее 3 анализов на протяжении 1 - 2 недель.

Методы консервации. Если исследование в день взятия материала невозможно (главным образом при массовых обследованиях), можно применять консерванты по Сафаралиеву или Берроузу.

Состав консерванта Сафаралиева: метиленовый синий - 0,2 г, 2% раствор сернокислого цинка - 82,5 мл, формалин концентрированный - 10 мл, уксусная кислота крепкая - 5 мл, фенол кристаллический - 2,5 г. Реактивы смешивают в указанном порядке. Фенол предварительно расплавляют на водяной бане.

Консервант разливается во флакончики до половины их объема. Подлежащий исследованию материал от каждого больного немедленно эмульгируется отдельной деревянной палочкой в отдельном флакончике в количестве, составляющем примерно 1/3 объема консерванта. Простейшие окрашиваются уже через 5 - 10 мин и при необходимости могут сохраняться в течение нескольких месяцев. Для исследования каплю осадка со дна пробирки с помощью пипетки помещают на предметное стекло и покрывают покровным. Микроскопируют при увеличении 10х60 или 10х40. Иммерсионную систему используют в случае необходимости изучить объект более детально. Консервировать можно как оформленный кал, так и жидкие патологические субстраты. В смеси длительно сохраняются и хорошо окрашиваются не только цисты, но и вегетативные формы амеб и других простейших.

Консервант Берроуза имеет следующий состав: хлорид натрия - 0,7 г, формалин концентрированный - 5,0 мл, спирт этиловый 96^о - 12,5 мл, фенол кристаллический - 2,0 г, вода дистиллированная - до 100 мл. Консервирование в нем производится таким же образом, как и в растворе Сафаралиева. Простейшие сохраняются в этом консерванте не дольше одного месяца. Для микроскопического исследования каплю осадка эмульгируют на предметном стекле в капле красящего раствора и покрывают покровным стеклом. В качестве красящего раствора используется 0,01% раствор тионина, азура или метиленового синего.

Метод обогащения. При скудном содержании простейших в кале они могут быть не обнаружены при микроскопировании нативных мазков и мазков с раствором Люголя. В этих случаях рекомендуется применить формалин-эфирное обогащение. Для этого кусочек кала величиной с горошину тщательно эмульгируют деревянной палочкой в центрифужной пробирке в 6 мл 10% раствора формалина на изотоническом растворе. В пробирку добавляют 2 мл эфира, закрывают резиновой пробкой, энергично встряхивают в течение 1 мин, а затем центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин или 1 мин при 2500 об/мин. После центрифугирования эмульсия разделяется на четыре слоя: окрашенный в желтый цвет верхний эфирный слой, слой фекалий (фекальная пробка), затем слой формалина и под ним осадок, в котором содержатся цисты простейших. Деревянной палочкой (отдельной для каждой пробы) слой фекалий отделяют от стенок пробирки и все содержимое ее, за исключением осадка, сливают. Наклонив пробирку отверстием книзу, быстро протирают ее стенки ватным или марлевым тампоном, стараясь удалить возможно большее количество жидкости, но не затрагивая осадок. Переворачивают пробирку отверстием вверх, переносят отдельной пипеткой осадок на предметное стекло, эмульгируют его в капле раствора Люголя и исследуют по обычной методике.

В случае необходимости приготовленную эмульсию можно хранить в закрытой резиновой пробкой пробирке до 2 сут.

В процессе приготовления центрифугата даже некоторые цисты простейших частично подвергаются деструкции. Вегетативные же их формы при этом совершенно разрушаются. Поэтому указанный метод непригоден для обнаружения трихомонад и диэнтамеб, которые не образуют цист, а также для исследования жидкого стула, в котором цисты отсутствуют.

Метод приготовления постоянных препаратов, окрашенных по Гейденгайну. Иногда в нативных мазках или в мазках с раствором иода точно определить вид простейшего не удается. Постоянные препараты, окрашенные по Гейденгайну, благодаря выявлению тонких структурных особенностей, позволяют распознавать простейших как по вегетативным формам, так и по цистам.

Для изготовления препаратов пригоден материал любой консистенции. Из жидкого стула мазки должны быть изготовлены сразу после дефекации. Обычно готовят не менее двух препаратов.

Процесс приготовления препаратов можно разделить на несколько этапов.

Фиксация:

- Концом деревянной палочки исследуемый кал тонким слоем быстро наносится на предметное или покровное стекло (следить, чтобы материал не подсох). Мазок погружают в фиксирующую жидкость Шаудина, налитую в чашку Петри. Жидкость состоит из 2 частей насыщенного раствора сулемы (8,5: 100; растворять при нагревании) и одной части 96^о спирта-ректификата,к которым добавляется ледяная уксусная кислота (3-5% к общему объему жидкости). Мазки фиксируются 15 - 20 минут.

- Мазки переносятся в 70^о спирт на 5 мин.

- Для окончательного удаления сулемы препараты помещаются на 5 - 10 минут в спирт-иод (в 70^о спирт добавляется несколько капель настойки иода до светло-коричневого цвета).

г) Для удаления иода препараты выдерживаются в 70^о спирте 5 мин. Если окраска не может быть произведена сразу, то их можно сохранять в спирте несколько дней.

Протрава и окраска:

- Перед окраской - промывка дистиллированной водой - 3 мин.

- Протрава в 2 - 3% водном растворе железо-аммиачных квасцов в течение 4-20 часов (в зависимости от температуры).Кристаллы квасцов должны быть слабо фиолетового цвета; желтые не пригодны.

- Быстрое (1-3 сек.) споласкивание в дистиллированной воде.

- Перенос для окраски в 0,5% раствор гематоксилина. Для его приготовления 1,0 г кристаллическюго гематоксилина растворяют в 10 см³ 96^о спирта, добавляют 90 см³ дистиллированной воды и выдерживают 10 - 20 дней. За 4-24 часа перед употреблением разводят наполовину дистиллированной водой.

- Промывка перекрашенного препарата водой в течение 10 - 20 мин.

Дифференцирование:

- Для извлечения избытка краски препарат помещают в 0,5 - 1% раствор железо-аммиачных квасцов и следят за обесцвечиванием до появления серо-лилового фона окраски препарата. На этом дифференцировку заканчивают, не доводя обесцвечивание до коричневого и желтого фона, что указывает на излишнее удаление краски, вследствие чего препараты становятся негодными.

- Промывка в водопроводной воде (лучше проточной) 20 - 40 мин.

Обезвоживание, просветление и заделка препарата:

- Помещение препарата последовательно в 70^о, 85^о и 96^о спирты, на 2 - 3 мин в каждый.

- Перенос в карбол-ксилол (25 грамм кристаллической карболовой кислоты растворить в 75 куб. см. ксилола) на 2 мин.

- Выдержать в чистом ксилоле 1 мин.

- На препарат поместить каплю канадского бальзама и накрыть покровным стеклом. Если при заделке в канадский бальзам появляется муть, значит обезвоживание было недостаточно и его надо повторить, заменив карбол-ксилол свежим.

Постоянные препараты, изготовленные таким методом, сохраняются без изменений годами. Он позволяет проводить совершенно точную диагностику простейших и дифференцйровать их от различных псевдопротозойных образований, часто наблюдаемых в кале, которые при недостаточном опыте могут быть приняты за вегетативные формы или цисты простейших.

Метод культивирования. Эффективным дополнительным методом диагностики в ряде случаев является метод культивирования. Рекомендуются следующие среды, наиболее простые по составу и дающие удовлетворительные результаты для культивирования дизентерийных амеб и других простейших кишечника (за исключением лямблий):

- Простая сывороточная среда - смесь из 9 частей стерильного изотонического раствора (0,85%) и 1 части нормальной лошадиной (или бычьей) сыворотки, разлитая в пробирки по 8 - 10 мл.

- Двухфазная сывороточная среда - на 19 частей бычьей сыворотки добавляют 1 часть мясопептонного бульона с 2% раствором глюкозы. Можно использовать также сыворотки других животных и остатки сывороток человека, поступающих в лабораторию для диагностических исследований. Смесь свертывают при 80^оС в течение 2 ч в косом положении, охлаждают, а затем заливают стерильным изотоническим раствором так, чтобы он перекрывал на 1 см верхний край скоса.

- Среда Павловой - хлорида натрия 8,5 г, двузамещенного фосфорно-кислого натрия 0,59 г, однозамещенного фосфорно-кислого калия 0,45 г, дистиллированной воды 1000 мл. После стерилизации в автоклаве (30 мин при давлении 1,5 атмосферы) и охлаждения в раствор добавляют стерильную лошадиную (или бычью) сыворотку в соотношении 1:20 и разливают среду в стерильные пробирки по 5 - 7 мл.

- Среда Райса представляет собой смесь 1 части мясопептонного бульона с 4 частями изотонического раствора, к которой добавляется нативная лошадиная или бычья сыворотки в соотношении 1:10. Среду стерильно разливают в пробирки по 8 - 10 мл.

Могут быть использованы и другие, более сложные по составу среды.

Для получения первичных культур простейших в пробирки со средой, предварительно проверенные на стерильность выдерживанием в термостате при температуре 37^оС в течение суток (или при комнатной температуре 3 сут.), вносится комочек оформленного кала величиной с горошину или 2 - 3 капли жидкого материала. Смесь гомогенизируют встряхиванием. Засевать одновременно нужно несколько пробирок (2 - 3). Перед посевом пробирки со средами подогревают до температуры 37^оС и в каждую добавляют 1 - 2 петли рисового крахмала. Его предварительно стерилизуют сухим жаром при температуре 90^оС по 1 часу 4 дня подряд в пробирках, закрытых ватными пробками.

Оптимальной температурой для культивирования является 37^оС. Результаты проверяются через каждые 24 ч в течение 5 сут. Для проверки со дна пробирки с помощью пипетки забирают каплю осадка с небольшим количеством жидкости, помещают на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Иммунологические методы. Эти методы еще недостаточно разработаны, но находят все более широкое применение, которое сдерживается, главным образом, из-за отсутствия централизованного производства сывороток и антигенов. Наиболее часто применяется реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), а также реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного анализа (ИФА), связывания комплемента (РСК), преципитации и некоторые другие.

Микрометрия. Размеры простейших и их ядер имеют важное значение для определения вида. Измерение производится при помощи окулярного микрометра представляющего собой линейку длиной 5 мм или 1 см с делениями, соответствующими 0,1 мм. Линейка нанесена на стекло, вмонтированное или вставляемое временно в окуляр микроскопа. Значение делений окулярного микрометра по отношению к измеряемым объектам для разных систем микроскопов и разных объективов предварительно определяется при помощи объектмикрометра. Он представляет собой линейку с делениями в 0,01 мм (10 мкм) на предметном стекле. Объектмикрометр помещают под объектив микроскопа и совмещают его линейку с линейкой окулярного микрометра. Устанавливают, какое число делений окулярного микрометра точно совпадает с определенным числом делений объектмикрометра. По этим данным вычисляют значение одного деления окулярной линейки в микронах или микрометрический коэффициент. Например, 10 делений окулярного микрометра соответствуют 2 делениям объектмикрометра. Тогда значение одного деления (микрометрический коэффициент) составит (2х10)/10=2мкм. Вычисление микрометрического коэффициента производят с точностью до десятых или (реже) сотых долей микрона. Для измерения какого-либо микроскопического объекта следует заменить обычный окуляр на микрометрический (или вставить в него микрометрическую линейку), определить в делениях последнего длину и ширину объекта (клетки простейшего, ее ядра) и, перемножив число делений на микрометрический коэффициент, найти размеры объекта в микронах. Точно так же измеряются другие объекты: яйца и личинки паразитических червей, псевдопротозойные образования и др.

Амебиаз

Aмебиаз - заболевание, вызываемое дизентерийной амебой (Епtamoeba histolytica). Эта амеба существует в виде двух различных вегетативных форм: крупной, или тканевой, и мелкой, или просветной (рис.15,16). Крупные формы наблюдаются в острых случаях болезни. Мелкие формы и образуемые ими цисты обнаруживаются у здоровых носителей, а также в период ремиссий у больных хроническим кишечным амебиазом, в начале болезни или в период вызоровления.

Заражение человека происходит через рот цистами дизентерийной амебы, из которых в кишечнике образуются просветные вегетативные формы (рис.17). Продолжительность инкубационного периода составляет от 1- 2 недель до 3 месяцев и дольше. Заболевание развивается в результате проникновения амеб в стенку толстой кишки. При этом мелкие просветные формы превращаются в крупные тканевые, выделяющие протеолитические ферменты, которые вызывают разрушение тканей, вследствие чего образуются глубокие язвы. Проникновению амеб из просвета кишечника в ткани благоприятствуют микротравмы и воспалительные изменения слизистой, возникающие вследствие действия микрофлоры и других причин. Из стенки кишки амебы часто проникают в другие органы.

Клиническое течение амебиаза разнообразно по своим проявлениям и степени тяжести. Основные его формы: кишечная (амебная дизентерия), внекишечная и бессимптомное носительство дизентерийной амебы.

Кишечный амебиаз может протекать в острой и хронической форме. В тяжелых случаях начальные проявления болезни и обострения характеризуются постепенным развитием диареи (от 3 до 15 раз в сутки). Стул, как правило, обильный, со стекловидной вязкой слизью, диффузно пропитанной кровью малинового цвета ("малиновое желе"). Иногда стул шоколадного цвета с примесью крупных комочков стекловидной слизи, окрашенной кровью в розовый цвет. В легких случаях стул кашицеобразный, с незначительным количеством крови и слизи, которые макроскопически могут даже не обнаруживаться. Самопроизвольное излечение наступает редко. Болезнь при отсутствии специфического лечения принимает хроническое течение со сменой периодов обострений и ремиссий.

Внекишечный амебиаз первично развивается как осложнение кишечного в результате заноса амеб из толстой кишки. Наиболее частой его формой является амебный абсцесс печени (амебный гепатит), реже - абсцессы легких, головного мозга, селезенки и других внутренних органов, а также поражения кожи. Амебные поражения внутренних органов могут возникать и при отсутствии клинических проявлений кишечного амебиаза или развиваться спустя продолжительное время после исчезновения амеб из кишечника.

Носительство дизентерийных амеб без каких-либо клинических проявлений болезни встречается гораздо чаще, чем клинически выраженные формы амебиаза, и может продолжаться неопределенно долго. У носителей амебы размножаются только в просвете толстой кишки, где ведут комменсальный образ жизни, не вызывая никаких патологических явлений. В этих случаях наблюдаются лишь мелкие (просветные) формы дизентерийной амебы и цисты. Носительство может продолжаться в течение многих лет. При некоторых условиях мелкие, просветные формы амеб превращаются в крупные, тканевые, и тогда носительство переходит в клинически выраженное заболевание амебиазом. Причиной этого могут быть различные инфекционные и неинфекционные заболевания, ведущие к ослаблению организма хозяина, различные интоксикации, в том числе и алкогольные, нарушения пищевого и водного режима, алиментарная дистрофия, тяжелые травмы и ранения.

Диагноз амебиаза может считаться установленным только при обнаружении дизентерийных амеб с фагоцитированными эритроцитами в цитоплазме. Такие амебы-гематофаги обычно выявляются в острой стадии болезни в кроваво-слизистых испражнениях (рис.18). При этом примерно в 50% случаев в препаратах встречаются кристаллы Шарко-Лейдена характерной вытянутой ромбовидной формы. При отсутствии в мазках кала амеб, но при подозрительной на амебиаз клинической картине, наличии кристаллов Шарко - Лейдена исследования повторяют до 5 - 6 раз, не чаще одного раза в сутки.

У больных амебиазом при улучшении состояния, а также у носителей амеб в жидких испражнениях обнаруживаются не гематофаги, а мелкие просветные вегетативные формы амеб, которые никогда не содержат в цитоплазме эритроцитов. Наряду с амебами в этих случаях могут выявляться и цисты. Обнаружение только просветных форм и цист дизентерийной амебы даже у больных кишечными заболеваниями еще не дает оснований для окончательного диагноза амебной дизентерии. Он может быть выставлен лишь при наличии в анамнезе данных, указывающих на амебиаз, перенесенный в прошлом.

Микроскопические препараты:

1. Крупные (тканевые) вегетативные формы дизентерийной амебы в нативном мазке, приготовленном из кроваво-слизистого стула больных амебной дизентерией, обнаруживаются среди одиночно разбросанных эритроцитов, лейкоцитов, макрофагов, а также бактерий, нередко грибов бластоцистов, которые имеют вид сильно преломляющих свет образований. Тело амебы неправильной, изменчивой формы, размерами 18 - 45 мкм, при движении может вытягиваться в длину до 60 мкм. Обращает на себя внимание выраженное разграничение его на внутренюю зернистую, более темную и мутную часть - эндоплазму и покрывающий ее наружный светлый, прозрачный слой - эктоплазму. В эндоплазме, в пищеварительных вакуолях, находятся фагоцитированные эритроциты, при большом количестве которых она принимает слабукю красновато-бурукю окраску. Могут встречаться амебы и без эритроцитов. При температуре 20^оС и выше (до 39 - 40^оС) амебы активно подвижны. Движение их осуществляется путем относительно быстрого, внезапного выбрасывания светлых прозрачных эктоплазматических псевдоподий. В образовавшуюся псевдоподию бурно, вихреобразно переливается эндоплазма с заключенными в ней эритроцитами, бактериями, грибками и пищевым детритом. Псевдоподия сглаживается и исчезает. Затем на этом же или в другом месте поверхности тела образуется новая псевдоподия, повторяется переливание цитоплазмы и амеба перемещается в определенном направлении. Иногда образуются сразу две псевдоподии. Одна из них постепенно увеличивается, а вторая исчезает. Наряду с активно подвижными амебами, встречаются отдельные малоподвижные особи, которые как бы "топчутся на месте". При охлаждении препарата подвижность амеб сначала замедляется, затем тело их округляется и они все становятся неподвижными. У живых неокрашенных дизентерийных амеб ядра не видны. Это служит одним из важных дифференциальных признаков, позволяющих отличать их от сходных по размерам и форме кишечных амеб (Е. соli). Помимо амеб в препаратах встречаются кристаллы Шарко-Лейдена характерной вытянутой ромбовидной формы.

2.Мелкая, или просветная, комменсальная форма дизентерийной амебы в нативном мазке имеет размеры 7 - 25 мкм (средний - 13 мкм). Разграничение тела на эктоплазму и эндоплазму обычно заметно лишь при образовании псевдоподий, формирующихся медленнее, чем у тканевых форм. В пищеварительных вакуолях содержатся бактерии, но никогда не бывает эритроцитов, даже если амебы находятся в кроваво-слизистых испражнениях (например, при бактериальной дизентерии). Ядро без окраски не видно. Обычно эти амебы обнаруживаются в небольшом количестве у здоровых носителей. Значительное их число в активно подвижном состоянии может указывать на начальную стадию амебной дизентерии или на перенесенное в недавнем прошлом обострение хронического амебиаза. В этих случаях, как и при клинически выраженном амебиазе кишечника, наряду с амебами, могут обнаруживаться кристаллы Шарко - Лейдена.

3.Крупные (тканевые) вегетативные формы дизентерийной амебы в препаратах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну, хорошо выделяются на фоне многочисленных эритроцитов, отдельных лейкоцитов, бактерий и других микроорганизмов. Размеры амеб варьируют от 12 - 15 до 22 - 45 мкм (в среднем - около 23 мкм). Тело их вытянутое, часто округлое, в большинстве случаев разграничено на светлоокрашенную гомогенную эктоплазму и мелкозернистую темную эндоплазму. У многих амеб в эндоплазме видны единичные или многочисленные (до нескольких десятков) темноокрашенные округлые включения - эритроциты. Величина их различна в зависимости от степени переваривания. Ядро круглое пузырьковидное, с тонкой оболочкой, на внутренней поверхности которой равномерным слоем в виде зубчиков расположены зерна хроматина. В центре ядра находится пятиугольная звездчатая кариосома. Диаметр ядра равен 3 - 9 мкм (в среднем - 5,2 мкм). В препарате могут встретиться амебы на различных стадиях дегенерации. Цитоплазма их грубо вакуолизирована, ядро уплотненное (пикнотическое), темноокрашенное. Приблизительно у 50% больных амебной дизентерией встречаются кристаллы Шарко - Лейдена. Они вытянутой ромбовидной формы разнообразной величины, окрашиваются гематоксилином в гомогенный темный цвет.

4. Мелкая (просветная) форма дизентерийной амебы в препаратах, окрашенных по Гейденгайну, имеет размеры тела от 7 до 24 мкм (средний - 13 мкм), ядро - от 2 до 5 мкм (в среднем 3,5 мкм). Зерна хроматина нередко образуют под ядерной оболочкой серповидное скопление, что служит отличительным признаком от ядер крупных форм амеб.

5.Цисты дизентерийной амебы в препаратах, окрашенных железным гематоксилином, имеют правильную круглую или овальную форму, с гладкой оболочкой. Размеры цист 10 - 15 мкм. В цитоплазме видны ядра: одно или два в незрелых цистах и четыре - в зрелых. В одном и том же препарате могут быть обнаружены одновременно незрелые и зрелые цисты. Размеры ядер в цистах различной степени зрелости неодинаковы: в одноядерных цистах ядро наиболее крупное (3 - 5 мкм), в двухъядерных - ядра средней величины (2,5 - 4 мкм), в четырехъядерных - самые мелкие (2 - 3 мкм). Ядра правильной круглой формы, с тонкой оболочкой и мелкой пятиугольной или точечной кариосомой в центре. Зерна периферического ядерного хроматина располагаются под ядерной оболочкой тонким равномерным слоем, но могут образовывать и серповидные скопления. В цитоплазме многих цист обнаруживаются хроматоидные тельца в виде коротких толстых палочек с закругленными концами. В наибольшем числе они содержатся в одноядерных цистах, реже и в меньшем количестве - в четырехъядерных. Гликогеновая вакуоль, характерная для незрелых цист, имеет вид светлого неокрашенного пятна.

6.Цисты дизентерийной амебы в препаратах, обработанных раствором Люголя, окрашиваются в желтый со светлокоричневым оттенком цвет. Общий вид их и размеры такие же, как и при окраске по Гейденгайну. В цитоплазме одно- и двухъядерных цист нередко встречаются гликогеновые вакуоли светло-бурого цвета, со смазанными контурами.

7. Микроскопические препараты Entamoeba coli.При дифференциальной диагностике необходимо отличать дизентерийных амеб от непатогенных видов, в частности, от кишечной амебы (Еntamoeba coli).

Вегетативные формы Е. соli в нативном мазке имеют размеры тела от 9 до 30 мкм (средний - 19 мкм). Цитоплазма грубо вакуолизирована. Вакуоли заполнены большим количеством бактерий, грибков, пищевого детрита. Иногда в вакуолях могут содержаться даже простейшие других видов. В патологическом кроваво-слизистом стуле больных с язвенными поражениями толстой кишки (при бактериальной дизентерии, раке и других заболеваниях) можно обнаружить экземпляры кишечных амеб с единичными фагоцитированными эритроцитами и лейкоцитами. Они отличаются более крупными размерами (13 - 45 мкм, средний - 23 мкм). Цитоплазма грубоячеистая, разграничения ее на экто- и эндоплазму обычно не отмечается. Движение амеб крайне вялое, почти незаметное. Лишь при длительном наблюдении можно заметить эктоплазматические псевдоподии, медленно появляющиеся в виде широких наплывов то с одной, то с другой стороны тела. В отличие от дизентерийной амебы, у живых кишечных амеб в неокрашенных препаратах обнаруживается ядро пузырьковидной формы. Под оболочкой ядра в виде отдельных глыбок неодинаковой величины и различной формы располагается периферический ядерный хроматин. Кариосома круглая, крупнее, чем у Е. histolytica, расположена эксцентрично. Диаметр ядра - от 2,5 до 9 мкм (средний - 4,8 мкм).

Е. соli в препаратах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну, сохраняет почти такие же размеры, как и в нативном мазке. Форма тела неправильная, овальная или круглая. Цитоплазма окрашивается в интенсивный серый или лиловый цвет, грубо вакуолизирована. Нередко одна из вакуолей, обычно самая крупная, имеет вытянутую веретеновидную форму. Пищевые включения в вакуолях - бактерии, грибки, изредка единичные эритроциты или лейкоциты, окрашиваются в темный цвет. Иногда в цитоплазме видны скопления мелких паразитических грибов Sphaerita. Ядро Entamоeba coli окрашивается более интенсивно, чем у Е. histolytica.Кариосома и периферический хроматин окрашены в интенсивно темный цвет. Кариосома круглая, крупнее, чем у E.histolitica,. Нередко рядом с ней имеется второе внутриядерное тельце меньших размеров. Хроматин прилегает к внутренней поверхности ядерной оболочки в виде глыбок неправильной формы и неодинаковой величины. Мелкие зерна ядерного хроматина густо располагаются между кариосомой и оболочкой ядра. Нередко ядро окружено узкой светлой неокрашенной зоной.

Цисты Е. соli в препаратах, окрашенных раствором Люголя, по форме не отличаются от цист дизентерийной амебы, однако овальные их формы встречаются чаще. Размеры цист более крупные: 10 - 30 мкм (средний - 18 мкм). Незрелые цисты обычно двухъядерные (с другим числом ядер крайне редки), зрелые - восьмиядерные. Иногда встречаются цисты с 16 и очень редко даже с 32 ядрами. Ядра круглой, реже овальной формы. Крупноточечная кариосома в них располагается эксцентрично. В незрелых цистах часто обнаруживается крупная резко контурированная темно-бурая гликогеновая вакуоль, оттесняющая цитоплазму и ядра к периферии. В зрелых цистах гликоген в виде вакуолей не обнаруживается (рис.20,1-3). В препаратах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну, размеры и форма цист такие же, как и при окраске йодом. Вакуоль имеет вид светлой неокрашенной зоны, занимающей всю центральную часть цисты.

Морфологические признаки других непатогенных амеб кишечника и их цист, используемые при дифференциальной диагностике E.histolytica показаны на рисунках 20 и 21 и приведены в таблицах 3 и 5.

Культуральные методы диагностики амебиаза имеют лишь вспомогательное значение. Основным недостатком их является то, что как крупные (тканевые), так и мелкие (просветные) формы амеб в культурах выглядят одинаково, что не дает возможности уверенно дифференцировать заболевание от носительства.

Иммунологические методы диагностики амебиаза: реакция связывания комплемента, реакция непрямой иммунофлюоресценции, реакция преципитации и некоторые другие, пока находят лишь ограниченное применение вследствие дефицита необходимых антигенов и сывороток. Использование этих методов особенно желательно в случаях подозрения на амебиаз.

Лямблиоз

Лямблиоз - заболевание, возбудителями которого являются лямблии (Lamblia intestinalis). Их вегетативные формы обитают обычно в верхних отделах тонкого кишечника (двенадцатиперстная кишка и начальный отдел тощей кишки). Они размножаются только в просвете кишечника, прикрепляясь к поверхности слизистой оболочки при помощи присосок, но изредка могут проникать и в ткани стенки кишки. Вместе с содержимым кишечника вегетативные формы лямблий попадают в толстую кишку, где превращаются в цисты, и с испражнениями выходят во внешнюю среду.

Клиника лямблиоза весьма разнообразна. Тяжелые случаи заболевания с летальным исходом не наблюдаются даже без лечения.

Серьезные патологоанатомические изменения, характерные только для лямблиоза, также не отмечены. Основными клиническими формами являются кишечная и печеночная.

Кишечная форма характеризуется явлениями дуоденита или энтероколита. Стул больных неустойчивый. Нормальный стул чередуется с кашицеобразным с примесью слизи, но без крови. Кишечные формы лямблиоза могут симулировать острый или хронический аппендицит; иногда появляются симптомы, отмечающиеся при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Известны также формы кишечного лямблиоза, протекающие при явлениях анацидного, гипоацидного и, реже, гиперацидного гастрита.

Печеночная форма дает клиническую картину холецистита, гепато-холецистита или холангита, может стимулировать приступы желчнокаменной болезни.

При обеих (кишечной и печеночной) формах лямблиоза часто отмечаются нарушение всасывания жиров и жирорастворимых витаминов в кишечнике. Нередки невротические симптомы (особенно у детей): слабость, раздражительность, плаксивость, быстрая утомляемость, головные боли, боли в области сердца, головокружения. Может наблюдаться также нарушение обменных процессов, задержка увеличения массы тела, возникновение анемии гипохромного типа.

Чаще встречаются латентный лямблиоз и носительство лямблий, которые могут переходить в клинические формы. Сопутствуя острым кишечным заболеваниям инфекционной и неинфекционной этиологии, лямблиоз способствует затяжному или хроническому их течению.

Диагноз лямблиоза при наличии соответствующих клинических симптомов устанавливается в случае нахождения вегетативных форм или цист паразита. Вегетативные формы обнаруживаются в дуоденальном содержимом и только в жидких испражнениях. Цисты встречаются, преимущественно в оформленном кале, в жидких фекалиях их находят лишь изредка.

Исследование дуоденального содержимого не дает особых преимуществ перед исследованием кала. Последний способ даже предпочтительнее в случаях, когда лямблии паразитируют только в тощей кишке и в дуоденальном содержимом обнаруживаются крайне редко. Кроме того, забор кала произвести проще, чем сделать дуоденальное зондирование. Исследование кала является единственным методом исследования в тех случаях, когда дуоденальное зондирование по каким-либо причинам невозможно. Однако, благодаря характерным движениям, вегетативные формы лямблий в дуоденальном содержимом выявляются легче, чем цисты в кале. Поэтому исследование дуоденального содержимого на лямблии должно быть обязательным во всех случаях зондирования больных с нарушением функций кишечника.

При любых способах исследования надо учитывать, что лямблии у многих больных выделяются периодически. Периоды, когда паразиты или их цисты выделяются в огромных количествах ("положительная фаза"), сменяются периодами очень скудного выделения ("отрицательная фаза"). В течение отрицательных фаз паразитов вообще бывает невозможно обнаружить. Длительность этих фаз колеблется от 2 - 3 сут до 2 - 3 недель. Поэтому при подозрении на лямблиоз исследования рекомендуется проводить с интервалом в одну неделю в течение 4-5 недель.

Вспомогательное значение в диагностике лямблиоза могут иметь результаты других, неспецифических лабораторных исследований. Например, в дуоденальном содержимом и в испражнениях больных лямблиозом обнаруживается большое количество слизи, лейкоцитов и клеток призматического кишечного эпителия, которые дегенерируют и слущиваются под действием присасывающихся лямблий. В большинства случаев клинически выраженного и длительно протекающего лямблиоза отмечается пониженное содержание гемоглобина в крови.

Микроскопические препараты лямблий. Нативные мазки при исследовании на лямблиоз готовят из дуоденального содержимого или жидких фекалий больных лямблиозом, выбирая слизистые сгустки, которые нередко сплошь состоят из лямблий, лейкоцитов и слизи. Лямблии передвигаются гораздо более активнее, чем амебы, благодаря наличию у них четырех пар жгутиков. Движение их относительно плавное, происходит преимущественно в одном направлении. Наряду с поступательным движением отмечается вращательное - повороты вокруг продольной оси тела. В зависимости от угла поворота можно наблюдать лямблий в разных проекциях. Форма тела паразита в дорсо-вентральной проекции грушевидная, передний конец его закругленный, широкий, а задний - узкий, заостренный. У переднего конца на вентральной стороне тела имеется присоска в форме светлого участка округлой формы. На фоне присоски иногда заметны симметрично расположенные два ядра. В боковой проекции тело лямблий имеет ковшевидную форму. Вентральная поверхность его уплощенная, а на месте присоски - вогнутая. Дорсальная поверхность тела выпуклая. Узкий хвостовой конец обычно загнут на дорсальную сторону. Благодаря различию формы лямблий в дорсо-вентральной и боковой поверхностях при их вращении во время движения, они чем-то напоминают падающий лист дерева ("движение типа падающего листа"), что служит весьма характетерным диагностическим признаком. Средние размеры лямблий составляют 10-28х8-12мкм.

Препараты цист лямблий, окрашенных раствором Люголя, приготовляются из оформленных фекалий лиц, обследуемых на лямблиоз. Цисты овальной формы. Задний конец обычно несколько шире переднего. Тонкая оболочка двуконтурная, гладкая. Цитоплазма многих цист отстает от оболочки, так что под оболочкой образуются длинные серповидные оптически пустые щели. Цисты окрашиваются йодом в коричневый, желтый или серовато-голубой цвет (рис.20,16-18). Последние называются голубыми цистами. У переднего конца цисты в цитоплазме располагаются два (в незрелых цистах) или четыре (в зрелых цистах) ядра. Они слабо заметны. Внутри цитоплазмы отчетливо видны идущие вдоль тела цисты искривленные тонкие нити свернутого жгутикового аппарата и располагающиеся в поперечном или косом направлении серповидные или в виде запятой парабазальные тела. Размеры цист лямблий 10 - 14 мкм в длину и 6 - 10 мкм в ширину. Голубые цисты мельче и внутренняя структура их видна плохо.

Препараты вегетативных форм и цист лямблий, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну, готовятся из тех же материалов, что и нативные мазки. Среди лейкоцитов, бактерий и слизи видны лямблии грушевидной или ковшеобразной формы. В их мелкозернистой цитоплазме на фоне светлоокрашенной присоски хорошо заметны два симметрично расположенных ядра. По средней линии в цитоплазме спереди назад проходят две парные нити (аксостили), начинающиеся от базальных зерен несколько кпереди от ядер и выходящие наружу в виде двух хвостовых жгутиков на заднем конце тела. От самостоятельных базальных зерен, находящихся также впереди ядер, начинаются еще три пары жгутиков - передняя, средняя и вентральная. Участки их, лежащие внутри цитоплазмы, видны хорошо, наружные же отрезки окрашиваются плохо и большей частью незаметны. Приблизительно на границе между задней и средней третями тела лямблии, в поперечном или косом направлении располагаются парабазальные тела - одно или два. Форма их серповидная, в виде запятой или треугольная (рис 24,а).

Кроме вегетативных форм в препарате встречаются цисты лямблий. Они выглядят так же, как и в мазках, окрашенных йодом, однако внутренние структуры и, особенно, ядра видны более четко (рис.24,б). В препаратах, приготовленных из оформленных фекалий лиц, инвазированных лямблиями, цисты обнаруживаются иногда в очень большом количестве.

Культуральные методы для диагностики лямблиоза не применяются.

Иммунологические реакции (РЭМА, НРИФ) применяются в научных исследованиях, но в широкую практику пока не вошли.