Лабораторная диагностика. Лабораторные методы диагностики токсоплазмоза основаны на паразитологических и иммунологических исследованиях

Лабораторные методы диагностики токсоплазмоза основаны на паразитологических и иммунологических исследованиях. Паразитологическая диагностика осуществляется методом прямого микроскопирования и методом биопроб.

Для прямого микроскопирования готовят мазки и отпечатки из пунктата или биопсированных частиц лимфатических узлов, миндалин, из центрифугата спинномозговой жидкости и крови, мазки и гистологические срезы из кусочков органов трупов (головного мозга, печени, селезенки). При патологии беременности исследуются плацента, плодные оболочки и околоплодная жидкость. Просматривать препараты следует тщательно, так как токсоплазм в исследуемом материале бывает мало и их можно спутать с другими простейшими или грибами. В препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе, токсоплазмы имеют полулунную или аркообразную форму. Один конец их клетки заострен, а другой закруглен. Относительно крупное ядро, как правило, располагается в центре клетки, занимая от 1/4 до 1/3 ее площади. Ядро окрашивается в различные оттенки рубиново-красного цвета, а цитоплазма - в голубые тона. Типичные размеры токсоплазм - 4-7 х 2-4 мкм (рис.6). Обнаружение в препаратах токсоплазм, расположенных внутри макрофагов или внеклеточно, имеет бесспорное диагностическое значение.

Выделение возбудителя производится методом биопроб, которые чаще всего ставят на белых мышах, так как у них редко встречается спонтанный токсоплазмоз, наблюдающийся у морских свинок, кроликов и других животных. При этом необходимо соблюдать меры предосторожности: работа должна проводиться в настольном боксе или за защитным стеклом, в перчатках и защитной маске. Из взятого стерильно исследуемого материала (обычно при отрицательных результатах микроскопии) готовится взвесь на стерильном физиологическом растворе и вводится мышам, как правило, внутрибрюшинно в дозе до 1 мл.

Кровь у больных с подозрением на токсоплазмоз, берут в количестве 3-4 мл. После оседания эритроцитов плазму отсасывают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Мышам вводят по 0,5 мл образовавшегося осадка. Спиномозговую жидкость обрабатывают так же как и кровь. К трупному материалу добавляют антибиотики. При наличии в инъецированном субстрате токсоплазм мыши заболевают и у них развивается асцит. На 3-4 день после заражения перитонеальный экссудат отсасывается шприцом в стерильную пробирку. Если его взять не удается, то в брюшную полость вводят 0,5 стерильного физиологического раствора, а затем отсасывают его обратно и переносят в пробирку. На окрашенных по Романовскому-Гимзе препаратах, приготовленных из экссудата, а также из тканей селезенки, печени, легких и других органов мышей, внутри и вне клеток обнаруживаются отдельные токсоплазмы и их скопления. Путем пассажей перитонеального экссудата на мышах можно поддерживать культуру токсоплазм с целью приготовления антигенов для серологических реакций. Материал, взятый для пассажа, желательно использовать немедленно, но допустимо сохранение его в условиях холодильника при 2-4°C в течение 1-2 суток.

При заражении маловирулентным штаммом заболевание у мышей клинически не проявляется; перитонеальный эксудат не образуется. В этих случаях за животными ведется наблюдение в течение 10-14 дней (иногда до месяца), а затем, если они не заболевают, проводят еще 3-5 слепых пассажей. Для этого обычно используются ткани головного мозга (иногда селезенки). При каждом пассаже производится контроль пассируемого материала методом прямой микроскопии препаратов. Для их приготовления скальпелем берут с поверхности разреза головного мозга небольшое количество мозгового вещества (желательно из коркового слоя), наносят его на предметное стекло и, накрыв другим стеклом, раздавливают. Окрашивают и просматривают препараты на обоих стеклах. В них можно обнаружить как свободно лежащие токсоплазмы, так и их цисты. При этом токсоплазмы необходимо дифференцировать от морфологически сходных с ними других простейших, нередко встречающихся в органах лабораторных животных (табл.2).

Таблица СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАРАЗИТОВ, СХОДНЫХ С TOXOPLASMA GONDII (по Тетмору с дополнениями и изменениями Д.Н.Засухина)

Признаки	Toxoplasma gondii	Besnoitia jellisoni	M-организм	Klossiella	Nosema
Размеры одиночных паразитов (микрометры)	5-7х3	7х2	5х2	4х8	2-4х1
Форма паразитов	в виде дольки апельсина	веретеновидная	веретеновидная	грушевидная	овальная
Форма концов паразита	один заострен, другой закруглен	оба заострены	оба заострены	один заострен, другой закруглен
Ядро	рыхлое	к о м п а к т н о е
Размеры псевдо цисты (микрометры)	20-100 и более	20-100	50-40	до 60	до 50
Форма псевдоцисты	Круг или овал	о к р у г л а я
Локализация	печень, селезенка, мозг, мышцы	глаз, мышцы и др.	мозг, мышцы	почки и др. органы	мозг, почки

Ведущее значение в клинической диагностике токсоплазмоза имеют ммунологические методы исследования: РНИФ, РИФ, ИФА, РСК.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Для проведения РНИФ используется коммерческий лиофилизированный антиген (ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи). Отобранные тонкие предметные стекла без царапин тщательно промывают и обезжиривают в смеси спирта с эфиром. Перед нанесением антигена стекла протирают чистой сухой хлопчатобумажной тканью.

С помощью абразива или лака плоскость стекла делят на десять полей (два ряда по пять полей). У одного края предметного стекла оставляют место для обозначения номера.

На каждое из десяти полей с помощью шприца с тонкой иглой наносят мазки антигена (разведение антигена указано на ампуле), представляющего собой взвесь токсоплазм. Диаметр мазка 3-4 мм. Мазки высушивают при комнатной температуре и хранят до использования при -10-15^оС.

Постановка реакции:

1. Предметные стекла с антигеном извлекают из холодильника, подсушивают при комнатной температуре, а затем помещают во влажную камеру на 10-15 мин.

На каждый мазок наносят каплю разведенной исследуемой сыворотки или ликвора. На одном стекле можно разместить и исследовать десять капель разных сывороток или одной сыворотки в десяти разведениях.

2. Препараты помещают во влажную камеру при 37^оС на 30 мин.

3. После инкубации их промывают в течение 5-10 мин. в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH=7,2. Смыв остатки ФСБ дистиллированной водой, препараты высушивают при комнатной температуре.

4. На мазки наносят стандартную меченую флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) антисыворотку против глобулинов человека (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи) в рабочем разведении, указанном на ампуле. Для увеличения контрастности препаратов и снижения неспецифического свечения к флюоресцирующей антисыворотке добавляют стандартный бычий альбумин, меченый родамином (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи) в указанном на ампуле разведении.

5. Препараты вновь помещают во влажную камеру при 37^оС на 30 мин.

6. Извлеченные из влажной камеры препараты промывают ФСБ pH=7,2, а затем дистиллированной водой так, как это описано в п.3.

7. Подсушенные препараты исследуют под люминисцентным микроскопом. Источником ультрафиолетовых лучей служит ртутная лампа ДРШ-250-3. Используют фильтры возбуждения СС 15-2+ФС 1-4 и запирающие фильтры ЖС 18+ЖЗС 19. Препараты изучают без покровных стекол с применением иммерсионного объектива 90x и бинокулярной насадки с окулярами 5x.

При постановке РНИФ ставят следующие контроли:

а) антиген + меченая антисыворотка

б) антиген + заведомо отрицательная сыворотка + меченая антисыворотка

в) антиген + заведомо положительная сыворотка + меченая антисыворотка

Учет результатов. При отрицательном результате токсоплазмы окрашиваются в красно-бурый цвет. При наличии в исследуемой сыворотке специфических антител наблюдается яркое желто-зеленое свечение по периферии токсоплазм.

За титр антител принимают максимальное разведение сыворотки, при котором еще сохраняется периферическое желто-зеленое свечение большинства токсоплазм в разных полях зрения. При этом светящийся ободок вокруг каждой из них должен быть непрерывным.

Отрицательный результат РНИФ при исследовании сыворотки в минимальных разведениях с большой вероятностью позволяет предположить отсутствие токсоплазмозной инвазии. Наличие ее подтверждается выявлением титра специфических антител 1:20 и выше. Увеличение титра антител в 4 и более раза при исследовании парных сывороток свидетельствует об активном инфекционном процессе.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Постановка ИФА осуществляется при помощи коммерческих тест-систем (НИИЭМ им. Пастера; ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи).

В состав набора входят:

- полистироловые планшеты, сенсибилизированные токсоплазменным антигеном (одноразового применения) - 2 шт;

- контрольная отрицательная сыворотка - 0,1 мл, 1 ампула/флакон;

- контрольная положительная сыворотка - 0,1 мл, 1 ампула/флакон;

- антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (коньюгат) - 2 ампулы;

- ортофенилендиамин (ОФД) - 5мг, 2 пробирки;

- твин-20 (детергент) - 1 ампула/флакон;

- навеска солей фосфатно-солевого буферного раствора №1 (ФСБ) - 1 пакет;

- навеска солей субстратного буферного раствора - 1 пакет.

Приготовление основных растворов для ИФА:

Раствор №1. Навеску солей фосфатно-солевого буферного раствора растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Раствор №2. Навеску солей субстратного буферного раствора растворяют в 25 мл дистиллированной воды.

Раствор №3. 0,5 мл твина растворяют в 1 л раствора №1.

Раствор №4. 1 таблетку гидроперита растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

Раствор №5. 1 мл концентрированной серной кислоты добавляют к 12 мл дистиллированной воды.

Методика проведения ИФА:

Перед началом работы необходимо убедиться в герметичности ампул. Нельзя использовать в работе ампулы с трещинами, некачественной запайкой.

1. Перед постановкой реакции планшеты отмывают трехкратно по 4-5 мин раствором №3 (буферный раствор вносят по 0,25-0,3 мл).

2. Флаконы с положительной и отрицательной контрольными сыворотками растворяют в 0,1 мл дистиллированной воды. Полученные растворы нативных сывороток можно хранить при температуре +4+2^оС в течение 5+2 суток или при температуре -20^оС до 2-х недель. Перед постановкой реакции сыворотки разводят в отношении 1:400. Для этого 10 мкл нативной сыворотки растворяют сначала в 200 мкл раствора №3 (получают разведение 1:20), а затем 10 мкл сыворотки этого разведения еще раз растворяют в 200 мкл раствора №3 и таким образом получают разведение 1:400. Растворы хранению не подлежат. Исследуемые сыворотки разводят по такому же принципу. При проведении скрининга все сыворотки, в том числе положительную и отрицательную контрольные сыворотки, вносят в лунки по 0,1 мл в разведении 1:400.

При проведении раститровки сывороток контрольные положительную и отрицательную сыворотки вносят в лунки двух вертикальных рядов планшета по 0,1 мл. В остальные лунки вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении от 1:400 до 1:51200. Планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат на 30 мин. при температуре +37+1^оС.

3. Планшеты отмывают четырехкратно, как указано в п.1.

4. Коньюгат разводят в 12 мл раствора №3. Полученное разведение коньюгата 1:20000 добавляют по 0,1 мл в каждую лунку планшета и помещают в термостат на 30+5 мин. при температуре 37+1^оС.

Реакцию сопровождают контролем коньюгата: в лунку с антигеном добавляют коньюгат и субстрат. Оптическая плотность (ОП) данного контроля не должна превышать 0,15.

5. Отмывают планшеты 5-6 раз, как указано в п.1.

6. ОФД растворяют в 12 мл раствора №2. Непосредственно перед внесением в лунки к раствору добавляют 0,17 мл раствора №4. Полученную субстратную смесь вносят в лунки по 0,1 мл и помещают на 15 мин. при температуре 20+1^оС в темноту. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,1 мл раствора №5.

Учет результатов:

Результаты реакции учитывают визуально или фотометрически при длине волны 492 нм. При визуальном учете появление желтого окрашивания в лунках с исследуемой сывороткой при отсутствии окрашивания отрицательной контрольной сыворотки свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результат считают положительным, если оптическая плотность исследуемой сыворотки в 2 и более раза превышает значение ОП отрицательной контрольной сыворотки в разведении 1:400, которое не должно превышать значение 0,2; при этом ОП положительной сыворотки должно быть значительно выше 0,2. Среднее значение ОП при контроле коньюгата не должно превышать 0,2. При положительных результатах исследуемых сывороток в разведении 1:400 проводят их дальнейшее титрование путем последовательных двукратных разведений. Положительным результатом считают то разведение сыворотки, ОП которой в 2 и более раза превышает ОП контрольной отрицательной сыворотки в соответствующем разведении, при этом ОП положительной сыворотки должна быть существенно больше 0,2. При визуальном учете исследуемую сыворотку (ее разведение) расценивают как положительно реагирующую, если наблюдается достаточно интенсивное окрашивание, заметно превосходящее окрашивание в лунках с отрицательной контрольной сывороткой.

Положительный результат однократного исследования любым из перечисленных методов свидетельствует лишь о том, что обследуемый пациент был инвазирован токсоплазмами. Для суждения о давности заражения и активности процесса небходимо проводить исследования парных сывороток,полученных через 2-3 недели, одновременно с помощью нескольких серологических реакций. Четырехкратное и более нарастание титров специфических антител, выявляемое несколькими серологическими реакциями, указывает на активность инфекционного процесса, а присутствие специфических IgM-антител - на недавнее первичное заражение. При определении IgM-антител с помощью стандартных вариантов методик РИФ и ИФА возможна регистрация ложноположительных результатов реакций, обусловленных присутствием в крови ревматоидного фактора. На фоне высокого содержания IgG-специфических антител обе указанные реакции могут давать ложноотрицательные результаты.