VI. Оцен­ка го­мо­ген­но­сти бел­ка

Го­мо­ген­ность или од­но­род­ность бел­ка – важ­ней­ший его па­ра­метр, по­сколь­ку свой­ст­ва бел­ка, его ами­но­кис­лот­ный со­став, осо­бен­но­сти вто­рич­ной и тре­тич­ной струк­ту­ры, функ­цио­наль­ную ак­тив­ность име­ет смысл оп­ре­де­лять толь­ко то­гда, ко­гда бе­лок ин­ди­ви­дуа­лен и не со­дер­жит да­же мель­чай­ших при­ме­сей дру­гих бел­ков.

Су­ще­ст­ву­ет не­сколь­ко спо­со­бов оцен­ки го­мо­ген­но­сти бел­ка. Са­мым про­стей­шим, дос­туп­ным, не тре­бую­щим слож­но­го обо­ру­до­ва­ния, яв­ля­ет­ся хро­ма­то­гра­фи­че­ский.

Для это­го ис­поль­зу­ет­ся так на­зы­вае­мый ме­тод ТСХ – тон­кос­лой­ной хро­ма­то­гра­фии (за­ри­со­вать ус­та­нов­ку для ТСХ).

По­сле­до­ва­тель­ность дей­ст­вий та­ко­ва:

На пла­стин­ку на­но­сят ад­сор­бент (крах­маль­ный, по­ли­ак­ри­ла­мид­ный гель или си­ли­ка­гель), под­су­ши­ва­ют. Вы­де­лен­ный в ин­ди­ви­ду­аль­ном кри­стал­ли­че­ском со­стоя­нии бе­лок рас­тво­ря­ют в чис­том рас­тво­ри­те­ле и на­но­сят не­боль­шое ко­ли­че­ст­во рас­тво­ра бел­ка на хро­ма­то­гра­фи­че­скую пла­стин­ку. По­сле это­го её по­ме­ща­ют в со­суд, на дно ко­то­ро­го на­ли­то не­боль­шое ко­ли­че­ст­во элю­ен­та (рас­тво­ри­те­ля, ко­то­рый мо­жет хо­ро­шо пе­ре­дви­гать­ся по хро­ма­то­гра­фи­че­ской пла­стин­ке и ув­ле­кать за со­бой бе­лок). За­кры­ва­ют со­суд для хро­ма­то­гра­фии. Элю­ент под­ни­ма­ет­ся вверх по пла­стин­ке, ув­ле­кая за со­бой бе­лок. По­сле то­го, как рас­тво­ри­тель дой­дет прак­ти­че­ски до края пла­стин­ки, её вы­ни­ма­ют, су­шат и про­яв­ля­ют па­ра­ми йо­да, или смот­рят в УФ-лу­чах.

Ес­ли бе­лок ин­ди­ви­ду­аль­ный, то пят­ныш­ко бел­ка, пе­ре­мес­тив­шее­ся из точ­ки вво­да бел­ка на пла­стин­ке на не­боль­шое рас­стоя­ние, бу­дет од­но. Ес­ли же бе­лок за­гряз­нен, пя­тен бу­дет как ми­ни­мум два. Од­на­ко в слу­чае, ес­ли под­виж­ность при­ме­сей в дан­ном элю­ен­те схо­жа с под­виж­но­стью бел­ка, хро­ма­то­гра­фи­че­ский ме­тод мо­жет ока­зать­ся не­эф­фек­тив­ным для оцен­ки го­мо­ген­но­сти бел­ка.

Бо­лее эф­фек­ти­вен ме­тод оцен­ки го­мо­ген­но­сти бел­ка по рас­тво­ри­мо­сти. По­лу­чен­ный бе­лок рас­тво­ря­ют в чис­том рас­тво­ри­те­ле, пе­рио­ди­че­ски из­ме­ряя оп­ти­че­ски­ми ме­то­да­ми ко­ли­че­ст­во бел­ка в рас­тво­ре. При этом ко­ли­че­ст­во бел­ка в рас­тво­ре по­на­ча­лу уве­ли­чи­ва­ет­ся про­пор­цио­наль­но вво­ди­мо­му в рас­твор кри­стал­ли­че­ско­му бел­ку, дос­ти­гая че­рез не­ко­то­рое вре­мя точ­ки на­сы­ще­ния, в ко­то­рой даль­ней­шее уве­ли­че­ние ко­ли­че­ст­ва бел­ка в твер­дой фа­зе не при­во­дит к уве­ли­че­нию его ко­ли­че­ст­ва в рас­тво­ре. Ес­ли же гра­фик име­ет из­лом в точ­ке на­сы­ще­ния, то ана­ли­зи­руе­мый бе­лок не го­мо­ге­нен.