III. Ме­то­ды вы­де­ле­ния бел­ков из био­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла

Для по­лу­че­ния в чис­том ви­де бел­ки обыч­но вы­де­ля­ют из при­род­ных объ­ек­тов. Толь­ко очень уз­кий пе­ре­чень бел­ков син­те­зи­ро­ван ис­кус­ст­вен­ным пу­тем (ин­су­лин, ри­бо­нук­леа­за, ли­зо­цим, ци­то­хро­мы и не­ко­то­рые гор­мо­ны). Од­на­ко син­тез бел­ков – чрез­вы­чай­но дли­тель­ная, тру­до­ем­кая и до­ро­го­стоя­щая про­це­ду­ра. По­это­му при­ме­ня­ет­ся очень ог­ра­ни­чен­но.

Все опе­ра­ции по вы­де­ле­нию бел­ка про­во­дят­ся при низ­ких тем­пе­ра­ту­рах (от 0 до 5⁰С) с ис­поль­зо­ва­ни­ем рас­тво­ров с низ­кой кон­цен­тра­ции и хи­ми­че­ских ре­ак­ти­вов «мяг­ко­го» дей­ст­вия.

Ос­нов­ным кри­те­ри­ем ус­пе­ха при вы­де­ле­нии бел­ков, его пер­вым эта­пом, яв­ля­ет­ся тща­тель­ное из­мель­че­ние био­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла вплоть до раз­ру­ше­ния кле­ток, по­сколь­ку ос­нов­ная мас­са функ­цио­ни­рую­щих бел­ков со­дер­жит­ся имен­но в клет­ках.

При этом ис­поль­зу­ют­ся спе­ци­аль­ные ме­ха­ни­че­ские при­спо­соб­ле­ния, а ино­гда – фи­зи­че­ские про­цес­сы.

Ме­ха­ни­че­ские при­спо­соб­ле­ния:

1) вал­ко­вые мель­ни­цы (вал­ки с тру­щи­ми­ся ме­тал­ли­че­ски­ми по­верх­но­стя­ми пе­ре­ти­ра­ют и раз­дав­ли­ва­ют по­да­вае­мый свер­ху ма­те­ри­ал);

2) ша­ро­вые мель­ни­цы (ме­тал­ли­че­ская ем­кость со сталь­ны­ми ша­ри­ка­ми, в ко­то­рую по­ме­ща­ет­ся био­ло­ги­че­ский ма­те­ри­ал, вра­ща­ет­ся, из­мель­чая его);

3) руч­ные и ме­ха­ни­че­ские го­мо­ге­ни­за­то­ры (по­строе­ны по ти­пу сту­пок с пес­ти­ка­ми или элек­три­че­ских мя­со­ру­бок);

4) при­бо­ры для про­дав­ли­ва­ния че­рез филь­е­ры (био­ло­ги­че­ский ма­те­ри­ал спе­ци­аль­ным прес­сом про­дав­ли­ва­ет­ся че­рез пе­ре­го­род­ку с тон­чай­ши­ми от­вер­стия­ми).

Фи­зи­че­ские про­цес­сы:

1) ме­тод по­пе­ре­мен­но­го за­мо­ра­жи­ва­ния и от­таи­ва­ния (при за­мо­ра­жи­ва­нии про­ис­хо­дит раз­ру­ше­ние кле­точ­ных сте­нок и ос­во­бо­ж­де­ние кле­точ­но­го со­дер­жи­мо­го);

2) ме­тод «азот­ной бом­бы» (на­сы­ще­ние био­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла азо­том под дав­ле­ни­ем, за­тем рез­кое умень­ше­ние дав­ле­ния);

3) ме­тод раз­ру­ше­ния ульт­ра­зву­ком (мо­жет по­вре­дить и са­ми мо­ле­ку­лы бел­ков; ис­поль­зу­ет­ся ред­ко).

Вто­рой этап вы­де­ле­ния бел­ков – их из­вле­че­ние из раз­ру­шен­но­го био­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла пе­ре­во­дом в рас­тво­ри­мое со­стоя­ние.

Из­вле­че­ние бел­ков ос­лож­ня­ет­ся тем, что по­ми­мо бел­ков из­мель­чен­ная био­мас­са все­гда со­дер­жит це­лый ком­плекс дру­гих ве­ществ (ли­пи­ды, уг­ле­во­ды, раз­лич­ные ме­та­бо­ли­ты и др.). От них не­об­хо­ди­мо обя­за­тель­но из­ба­вить­ся. Для это­го био­ло­ги­че­ский ма­те­ри­ал об­ра­ба­ты­ва­ют со­ле­вы­ми рас­тво­ра­ми с кон­цен­тра­ци­ей 8–10%. Про­цесс про­во­дят пу­тем вы­дер­жи­ва­ния из­мель­чен­ной био­ло­ги­че­ской мас­сы в дан­ном рас­тво­ре в те­че­ние не­сколь­ких ча­сов или да­же не­сколь­ких су­ток при по­сто­ян­ном пе­ре­ме­ши­ва­нии.

Эф­фек­тив­ность рас­тво­ряю­ще­го дей­ст­вия со­лей от­дель­но по ка­тио­нам и анио­нам в по­ряд­ке убы­ва­ния вы­гля­дит сле­дую­щим об­ра­зом:

Li⁺ > K⁺ > Na⁺

P₂O₇^4– > B₄O₇^2– > PO₄^3– > CNS^– > HCO₃^– > I^– > Cl^–

По­сколь­ку бел­ки пред­став­ля­ют со­бой за­ря­жен­ные био­по­ли­ме­ры с оп­ре­де­лен­ным со­от­но­ше­ни­ем от­ри­ца­тель­ных и по­ло­жи­тель­ных за­ря­дов, их рас­тво­ри­мость раз­лич­на в рас­тво­рах с раз­ны­ми зна­че­ния­ми рН. Для из­вле­че­ния нуж­ных бел­ков ис­поль­зу­ют спе­ци­аль­ные бу­фер­ные вод­но-со­ле­вые сме­си.

Так­же для из­вле­че­ния ис­поль­зу­ют вод­но-спир­то­вые, спир­то-со­ле­вые сме­си и гли­це­рин. Бо­лее позд­ни­ми ме­то­да­ми из­вле­че­ния яв­ля­ет­ся об­ра­бот­ка био­ло­ги­че­ско­го ма­те­риа­ла рас­тво­ра­ми де­тер­ген­тов (до­де­цил­суль­фа­та на­трия, де­зок­си­хо­ла­та на­трия и т.д.).