 |
Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | |
IV. Разделение белков
|
|
Разделение белков является необходимым этапом их выделения в свободном, возможно кристаллическом состоянии. Существует несколько основных методик разделения белков:
1) Фракционирование белков солевыми растворами или фракционное высаливание. Метод основан на различной растворимости белков в растворах солей с определенной концентрацией. Варьируя концентрацию солевых растворов от минимальной до максимальной, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки или, в крайнем случае, довольно узкие фракции белков. Для определения границ концентраций соли, в которых происходит осаждение определенных белков, строят разностные диаграммы.
В некоторых случаях применяют осаждение спиртами, спирто-солевыми смесями или солями тяжелых металлов.
2) Метод электрофореза. Поскольку молекулы белков чаще всего обладают суммарным положительным или отрицательным зарядом, для их разделения целесообразно использовать постоянный электрический ток (малой силы, но большого напряжения), пропускаемый через белковый раствор. При этом положительно заряженные белковые молекулы движутся к катоду, а отрицательные – к аноду. Разделение белков более эффективно не в растворах, а в тонких слоях сорбентов полимерного строения (силикагеля, целлюлозы, ацетилцеллюлозы, геля агар-агара, крахмальном и полиакриламидном гелях). Этот метод называется электрофорезом в поддерживающих средах. Особый эффект достигается в гелях полимеров, имеющих трёхмерное строение, и обладающих регулируемым размером пространственных ячеек, по которым движутся молекулы белка (гель сополимера акриламида и метиленбисакриламида).
При электрофорезе белковых растворов необходимо поддерживать некоторые параметры в определенных границах: ионную силу раствора, рН, состав буферных смесей, а также величины приложенных потенциалов.
Описанные методы наиболее эффективны для фракционного разделения белков, однако недостаточно эффективны для их индивидуализации.
Для получения индивидуальных белков чаще всего используются хроматографический метод и метод молекулярных сит.
3) Хроматографический метод разделения белковых фракций заключается в пропускании белковой смеси, подлежащей разделению, через хроматографическую колонку, заполненную адсорбентом (метод колоночной хроматографии, основанный Цветтом в 1903 г.). В качестве адсорбента используются разнообразные неорганические и органические вещества: гель фосфата кальция, силикагель, производные целлюлозы, декстран и т.д. Помимо разделяемой белковой смеси используют элюент – обычно раствор нескольких солей в воде или смесь жидких органических веществ, который добавляют в хроматографическую колонку после белкового раствора. Элюент способствует прохождению белкового раствора через колонку и вымывает его с адсорбента. Из колонки выходят порции элюента, содержащие чистый белок.
Химики иногда применяют в качестве адсорбента вещества, избирательно связывающие определенные белки, что приводит к резкому повышению эффективности хроматографии. Такой способ называется афинной хроматографией или хроматографией сродства.
4) Метод молекулярных сит – разновидность хроматографии, в которой роль адсорбента играет сефадекс (обработанный эпихлоргидрином полисахарид декстран), имеющий сетчатую трёхмерную структуру с поперечными связями между полимерными цепочками. Размеры ячеек сетчатой структуры можно варьировать. Гранулы сефадекса, помещенные в хроматографическую колонку, достаточно легко пропускают крупные молекулы белка, а маленькие молекулы остаются в нишах трёхмерной сетки. Поскольку гранулы сефадекса склонны к сильному разбуханию с образованием геля, этот метод также называют методом гельфильтрации.
Дата публикования: 2015-02-22; Прочитано: 1402 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!
