Студопедия.Орг Главная | Случайная страница | Контакты | Мы поможем в написании вашей работы!  
 

IV. Раз­де­ле­ние бел­ков



Раз­де­ле­ние бел­ков яв­ля­ет­ся не­об­хо­ди­мым эта­пом их вы­де­ле­ния в сво­бод­ном, воз­мож­но кри­стал­ли­че­ском со­стоя­нии. Су­ще­ст­ву­ет не­сколь­ко ос­нов­ных ме­то­дик раз­де­ле­ния бел­ков:

1) Фрак­цио­ни­ро­ва­ние бел­ков со­ле­вы­ми рас­тво­ра­ми или фрак­ци­он­ное вы­са­ли­ва­ние. Ме­тод ос­но­ван на раз­лич­ной рас­тво­ри­мо­сти бел­ков в рас­тво­рах со­лей с оп­ре­де­лен­ной кон­цен­тра­ци­ей. Варь­и­руя кон­цен­тра­цию со­ле­вых рас­тво­ров от ми­ни­маль­ной до мак­си­маль­ной, мож­но один за дру­гим вы­де­лить от­но­си­тель­но чис­тые ин­ди­ви­ду­аль­ные бел­ки или, в край­нем слу­чае, до­воль­но уз­кие фрак­ции бел­ков. Для оп­ре­де­ле­ния гра­ниц кон­цен­тра­ций со­ли, в ко­то­рых про­ис­хо­дит оса­ж­де­ние оп­ре­де­лен­ных бел­ков, стро­ят раз­но­ст­ные диа­грам­мы.

В не­ко­то­рых слу­ча­ях при­ме­ня­ют оса­ж­де­ние спир­та­ми, спир­то-со­ле­вы­ми сме­ся­ми или со­ля­ми тя­же­лых ме­тал­лов.

2) Ме­тод элек­тро­фо­ре­за. По­сколь­ку мо­ле­ку­лы бел­ков ча­ще все­го об­ла­да­ют сум­мар­ным по­ло­жи­тель­ным или от­ри­ца­тель­ным за­ря­дом, для их раз­де­ле­ния це­ле­со­об­раз­но ис­поль­зо­вать по­сто­ян­ный элек­три­че­ский ток (ма­лой си­лы, но боль­шо­го на­пря­же­ния), про­пус­кае­мый че­рез бел­ко­вый рас­твор. При этом по­ло­жи­тель­но за­ря­жен­ные бел­ко­вые мо­ле­ку­лы дви­жут­ся к ка­то­ду, а от­ри­ца­тель­ные – к ано­ду. Раз­де­ле­ние бел­ков бо­лее эф­фек­тив­но не в рас­тво­рах, а в тон­ких сло­ях сор­бен­тов по­ли­мер­но­го строе­ния (си­ли­ка­ге­ля, цел­лю­ло­зы, аце­тил­цел­лю­ло­зы, ге­ля агар-ага­ра, крах­маль­ном и по­ли­ак­ри­ла­мид­ном ге­лях). Этот ме­тод на­зы­ва­ет­ся элек­тро­фо­ре­зом в под­дер­жи­ваю­щих сре­дах. Осо­бый эф­фект дос­ти­га­ет­ся в ге­лях по­ли­ме­ров, имею­щих трёх­мер­ное строе­ние, и об­ла­даю­щих ре­гу­ли­руе­мым раз­ме­ром про­стран­ст­вен­ных яче­ек, по ко­то­рым дви­жут­ся мо­ле­ку­лы бел­ка (гель со­по­ли­ме­ра ак­ри­ла­ми­да и ме­ти­лен­би­сак­ри­ла­ми­да).

При элек­тро­фо­ре­зе бел­ко­вых рас­тво­ров не­об­хо­ди­мо под­дер­жи­вать не­ко­то­рые па­ра­мет­ры в оп­ре­де­лен­ных гра­ни­цах: ион­ную си­лу рас­тво­ра, рН, со­став бу­фер­ных сме­сей, а так­же ве­ли­чи­ны при­ло­жен­ных по­тен­циа­лов.

Опи­сан­ные ме­то­ды наи­бо­лее эф­фек­тив­ны для фрак­ци­он­но­го раз­де­ле­ния бел­ков, од­на­ко не­дос­та­точ­но эф­фек­тив­ны для их ин­ди­ви­дуа­ли­за­ции.

Для по­лу­че­ния ин­ди­ви­ду­аль­ных бел­ков ча­ще все­го ис­поль­зу­ют­ся хро­ма­то­гра­фи­че­ский ме­тод и ме­тод мо­ле­ку­ляр­ных сит.

3) Хро­ма­то­гра­фи­че­ский ме­тод раз­де­ле­ния бел­ко­вых фрак­ций за­клю­ча­ет­ся в про­пус­ка­нии бел­ко­вой сме­си, под­ле­жа­щей раз­де­ле­нию, че­рез хро­ма­то­гра­фи­че­скую ко­лон­ку, за­пол­нен­ную ад­сор­бен­том (ме­тод ко­ло­ноч­ной хро­ма­то­гра­фии, ос­но­ван­ный Цвет­том в 1903 г.). В ка­че­ст­ве ад­сор­бен­та ис­поль­зу­ют­ся раз­но­об­раз­ные не­ор­га­ни­че­ские и ор­га­ни­че­ские ве­ще­ст­ва: гель фос­фа­та каль­ция, си­ли­ка­гель, про­из­вод­ные цел­лю­ло­зы, дек­ст­ран и т.д. По­ми­мо раз­де­ляе­мой бел­ко­вой сме­си ис­поль­зу­ют элю­ент – обыч­но рас­твор не­сколь­ких со­лей в во­де или смесь жид­ких ор­га­ни­че­ских ве­ществ, ко­то­рый до­бав­ля­ют в хро­ма­то­гра­фи­че­скую ко­лон­ку по­сле бел­ко­во­го рас­тво­ра. Элю­ент спо­соб­ст­ву­ет про­хо­ж­де­нию бел­ко­во­го рас­тво­ра че­рез ко­лон­ку и вы­мы­ва­ет его с ад­сор­бен­та. Из ко­лон­ки вы­хо­дят пор­ции элю­ен­та, со­дер­жа­щие чис­тый бе­лок.

Хи­ми­ки ино­гда при­ме­ня­ют в ка­че­ст­ве ад­сор­бен­та ве­ще­ст­ва, из­би­ра­тель­но свя­зы­ваю­щие оп­ре­де­лен­ные бел­ки, что при­во­дит к рез­ко­му по­вы­ше­нию эф­фек­тив­но­сти хро­ма­то­гра­фии. Та­кой спо­соб на­зы­ва­ет­ся афин­ной хро­ма­то­гра­фи­ей или хро­ма­то­гра­фи­ей срод­ст­ва.

4) Ме­тод мо­ле­ку­ляр­ных сит – раз­но­вид­ность хро­ма­то­гра­фии, в ко­то­рой роль ад­сор­бен­та иг­ра­ет се­фа­декс (об­ра­бо­тан­ный эпи­хлор­гид­ри­ном по­ли­са­ха­рид дек­ст­ран), имею­щий сет­ча­тую трёх­мер­ную струк­ту­ру с по­пе­реч­ны­ми свя­зя­ми ме­ж­ду по­ли­мер­ны­ми це­поч­ка­ми. Раз­ме­ры яче­ек сет­ча­той струк­ту­ры мож­но варь­и­ро­вать. Гра­ну­лы се­фа­дек­са, по­ме­щен­ные в хро­ма­то­гра­фи­че­скую ко­лон­ку, дос­та­точ­но лег­ко про­пус­ка­ют круп­ные мо­ле­ку­лы бел­ка, а ма­лень­кие мо­ле­ку­лы ос­та­ют­ся в ни­шах трёх­мер­ной сет­ки. По­сколь­ку гра­ну­лы се­фа­дек­са склон­ны к силь­но­му раз­бу­ха­нию с об­ра­зо­ва­ни­ем ге­ля, этот ме­тод так­же на­зы­ва­ют ме­то­дом гель­фильт­ра­ции.





Дата публикования: 2015-02-22; Прочитано: 1401 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!



studopedia.org - Студопедия.Орг - 2014-2024 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.007 с)...