XI. Струк­ту­ра бел­ко­вой мо­ле­ку­лы

Ос­нов­ной тео­ри­ей строе­ний бел­ка яв­ля­ет­ся по­ли­пеп­тид­ная. Она бы­ла пред­ло­же­на Э. Фи­ше­ром в 1902 го­ду на ба­зе вы­дви­ну­тых А.Я.Да­ни­лев­ским идей о ро­ли пеп­тид­ной свя­зи –C(O)–NH– в строе­нии бел­ков. Со­глас­но тео­рии Э. Фи­ше­ра мо­ле­ку­ла бел­ка пред­став­ля­ет со­бой ги­гант­ский по­ли­пеп­тид, по­стро­ен­ный из де­сят­ков и со­тен ами­но­кис­лот­ных ос­тат­ков, со­еди­нен­ных друг с дру­гом пеп­тид­ны­ми свя­зя­ми. На при­ме­ре уча­ст­ка по­ли­пеп­тид­ной це­пи рас­смот­рим уг­лы ме­ж­ду свя­зя­ми и рас­стоя­ния ме­ж­ду ато­ма­ми в мо­ле­ку­ле бел­ка:

где A⁰ – анг­с­т­рем; 1 A⁰ = 10^–10 м.

Для по­ли­пеп­тид­ной це­пи ха­рак­тер­ны не­ко­то­рые осо­бен­но­сти строе­ния:

1) Ха­рак­тер­ной осо­бен­но­стью строе­ния по­ли­пеп­тид­ной це­пи яв­ля­ет­ся то, что ато­мы уг­ле­ро­да и азо­та в её хреб­те рас­по­ло­же­ны при­бли­зи­тель­но в од­ной плос­ко­сти, а ато­мы во­до­ро­да и ра­ди­ка­лы на­прав­ле­ны к этой плос­ко­сти под уг­лом 109⁰28’.

2) Дру­гой осо­бен­но­стью строе­ния по­ли­пеп­тид­ной це­пи яв­ля­ет­ся осо­бый ха­рак­тер пеп­тид­ной свя­зи, ко­то­рая име­ет про­ме­жу­точ­ный ха­рак­тер ме­ж­ду оди­нар­ной и двой­ной свя­зя­ми, что вид­но по её дли­не – 1,32 A⁰. Это свя­за­но с на­ли­чи­ем тау­то­ме­рии, в ко­то­рой атом во­до­ро­да мо­жет пе­ре­хо­дить от ато­ма ки­сло­ро­да к ато­му азо­та:

Еноль­ная фор­ма пеп­тид­ной свя­зи наи­бо­лее ре­ак­ци­он­но­спо­соб­на. Бла­го­да­ря это­му бел­ки да­ют цвет­ные ре­ак­ции.

3) Ещё од­ним важ­ным свой­ст­вом по­ли­пеп­тид­ной це­пи яв­ля­ет­ся то, что глав­ная мо­но­тон­но по­стро­ен­ная цепь («хре­бет») ок­ру­же­на (об­рам­ле­на) раз­но­об­раз­ны­ми по сво­ей хи­ми­че­ской при­ро­де ра­ди­ка­ла­ми, ко­то­рые в ос­нов­ном и оп­ре­де­ля­ют круг хи­ми­че­ских ре­ак­ций, свой­ст­вен­ных бел­ко­вой мо­ле­ку­ле.

По­сле­до­ва­тель­ность рас­по­ло­же­ния ами­но­кис­лот­ных ос­тат­ков в по­ли­пеп­тид­ной це­пи в бел­ко­вой мо­ле­ку­ле на­зы­ва­ет­ся пер­вич­ной струк­ту­рой бел­ка.

Ус­та­нов­ле­ние пер­вич­ной струк­ту­ры – оп­ре­де­ляю­щий этап в ус­та­нов­ле­нии пол­ной хи­ми­че­ской фор­му­лы бел­ка. Впер­вые этой про­бле­мой стал за­ни­мать­ся анг­лий­ский био­хи­мик, лау­ре­ат Но­бе­лев­ской пре­мии, Ф. Сен­гер. Он раз­ра­бо­тал стра­те­гию, ко­то­рая ис­поль­зу­ет­ся и до сих пор.

Для оп­ре­де­ле­ния пер­вич­ной струк­ту­ры бел­ко­вой мо­ле­ку­лы не­об­хо­ди­мо осу­ще­ст­вить 6 ос­нов­ных ста­дий ис­сле­до­ва­ний.

I ста­дия:

Оп­ре­де­ле­ние ами­но­кис­лот­но­го со­ста­ва бел­ка. Бе­лок под­вер­га­ют пол­но­му гид­ро­ли­зу и с по­мо­щью ами­но­кис­лот­но­го ана­ли­за ус­та­нав­ли­ва­ют ка­че­ст­вен­ный и ко­ли­че­ст­вен­ный ами­но­кис­лот­ный со­став. Ана­лиз про­во­дят хро­ма­то­гра­фи­че­ским ме­то­дом.

II ста­дия:

Иден­ти­фи­ка­ция ами­но- и кар­бок­си­кон­це­вых ос­тат­ков по­ли­пеп­тид­ной це­пи. На­ча­лом по­ли­пеп­тид­ной це­пи счи­та­ют тот ко­нец, ко­то­рый со­дер­жит ами­но­груп­пу, а окон­ча­ни­ем – ко­нец, со­дер­жа­щий кар­бок­силь­ную груп­пу:

Су­ще­ст­ву­ет не­сколь­ко ме­то­дов оп­ре­де­ле­ния N-кон­це­вых ами­но­кис­лот:

а) Взаи­мо­дей­ст­вие по­ли­пеп­тид­ной це­пи с 2,4-ди­нит­роф­тор­бен­зо­лом.

б) Взаи­мо­дей­ст­вие по­ли­пеп­тид­ной це­пи с дан­си­лом с об­ра­зо­ва­ни­ем со­от­вет­ст­вую­ще­го дан­силь­но­го про­из­вод­но­го N-кон­це­вой ами­но­кис­ло­ты.

Вто­рую с N-кон­ца ами­но­кис­ло­ту мож­но оп­ре­де­лить по ме­то­ду Ф. Сен­ге­ра с по­мо­щью гид­ра­зи­но­ли­за:

Об­ра­зо­вав­ший­ся ги­ра­зид ами­но­кис­ло­ты вво­дят в ре­ак­цию с бен­заль­де­ги­дом. При этом об­ра­зу­ет­ся гид­ра­зон, ко­то­рый мо­жет быть лег­ко иден­ти­фи­ци­ро­ван.

III ста­дия:

Рас­ще­п­ле­ние по­ли­пеп­тид­ной це­пи на фраг­мен­ты, со­дер­жа­щие 15–30 ами­но­кис­лот­ных ос­тат­ков с по­мо­щью спе­ци­аль­ных фер­мен­тов по оп­ре­де­лен­ным пеп­тид­ным свя­зям.

Так, на­при­мер, трип­син рас­ще­п­ля­ет пеп­тид­ные свя­зи в том мес­те, где со­дер­жат­ся ос­тат­ки ли­зи­на или ар­ги­ни­на, хи­мот­рип­син – по ос­тат­кам трип­то­фа­на, фе­ни­ла­ла­ни­на или ти­ро­зи­на. Да­лее про­из­во­дят раз­де­ле­ние оли­го­пеп­ти­дов с по­мо­щью хро­ма­то­гра­фии.

IV ста­дия:

Оп­ре­де­ле­ние по­сле­до­ва­тель­но­сти ами­но­кис­лот­ных ос­тат­ков в ка­ж­дом оли­го­пеп­ти­де ме­то­дом Эд­ма­на. В 1950 г. Эд­ман пред­ло­жил так на­зы­вае­мый фе­ни­ли­зо­тио­циа­нат­ный ме­тод оп­ре­де­ле­ния ами­но­кис­лот­ной по­сле­до­ва­тель­но­сти в не­боль­ших по дли­не по­ли­пеп­тид­ных ос­тат­ках.

Ме­то­ди­ка Эд­ма­на ис­поль­зу­ет при­бор, на­зы­вае­мый се­к­ве­на­тор. Со­вре­мен­ные се­к­ве­на­то­ры спо­соб­ны оп­ре­де­лять ами­но­кис­лот­ную по­сле­до­ва­тель­ность не толь­ко в ко­рот­ких оли­го­пеп­ти­дах, но и в не­боль­ших бел­ках. Се­к­ве­на­тор ра­бо­та­ет по ре­ак­ции Эд­ма­на:

По фе­нил­тио­ги­дан­тои­ну ами­но­кис­ло­ты лег­ко ус­та­нав­ли­ва­ют при­ро­ду N-кон­це­вой ами­но­кис­ло­ты.

V ста­дия:

Рас­ще­п­ле­ние ис­ход­ной по­ли­пеп­тид­ной це­пи бел­ка ещё ка­ким-ли­бо спо­со­бом с ис­поль­зо­ва­ни­ем реа­ген­тов спе­ци­фи­че­ско­го дей­ст­вия, от­лич­но­го от дей­ст­вия трип­си­на или хи­мот­рип­си­на. На­при­мер, бром­ци­ан BrCN рас­ще­п­ля­ет пеп­тид­ные свя­зи со сто­ро­ны кар­бок­си­кон­це­вой ами­но­кис­ло­ты.

В ре­зуль­та­те по­лу­ча­ют дру­гой на­бор оли­го­пеп­ти­дов, ко­то­рый раз­де­ля­ют хро­ма­то­гра­фи­че­ски и ана­ли­зи­ру­ют фе­ни­ли­зо­тио­циа­нат­ным ме­то­дом (ста­дия IV).

VI ста­дия:

Ус­та­нов­ле­ние по­ряд­ка рас­по­ло­же­ния по­ли­пеп­тид­ных ос­тат­ков по пе­ре­кры­ваю­щим­ся уча­ст­кам. Про­во­дят тща­тель­ное срав­не­ние с по­мо­щью ком­пь­ю­тер­ной про­грам­мы че­ре­до­ва­ния ами­но­кис­лот в оли­го­пеп­ти­дах и вы­яв­ля­ют оли­го­пеп­ти­ды из вто­ро­го на­бо­ра с пе­ре­кры­ваю­щи­ми­ся по­сле­до­ва­тель­но­стя­ми пер­во­го на­бо­ра, что в ито­ге по­зво­ля­ет пра­виль­но со­еди­нить оли­го­пеп­тид­ные фраг­мен­ты, по­лу­чен­ные в ре­зуль­та­те пер­вич­но­го рас­ще­п­ле­ния ис­ход­ной по­ли­пеп­тид­ной це­пи.

Ес­ли по­ли­пеп­тид­ная цепь слиш­ком слож­ная, то про­во­дят 3-е, 4-е и по­сле­дую­щие рас­ще­п­ле­ния, по­ка не уда­ст­ся од­но­знач­но в пра­виль­ном по­ряд­ке со­еди­нить оли­го­пеп­тид­ные фраг­мен­ты.

Од­на­ко про­стран­ст­вен­ное строе­ние лю­бо­го, да­же са­мо­го про­сто­го бел­ка, зна­чи­тель­но от­ли­ча­ет­ся от той ни­те­вид­ной фор­мы, ко­то­рую при­да­ет бел­ку пер­вич­ная струк­ту­ра – ами­но­кис­лот­ная по­сле­до­ва­тель­ность. Прак­ти­че­ски пол­но­стью трёх­мер­ная мо­дель бел­ка со­от­вет­ст­ву­ет ли­ней­ной по­ли­пеп­тид­ной це­пи лишь в фиб­рои­не шел­ка. Все ос­таль­ные бел­ки, да­же фиб­рил­ляр­ные, прак­ти­че­ски не со­дер­жат ли­ней­ных рас­тя­ну­тых по­ли­пеп­тид­ных це­пей. На ос­но­ва­нии рент­ге­но­ст­рук­тур­ных ана­ли­зов бел­ко­вых мо­ле­кул бы­ли пред­ло­же­ны мо­де­ли свёр­ты­ва­ния по­ли­пеп­тид­ных це­пей и фор­ми­ро­ва­ния так на­зы­вае­мых вто­рич­ной, тре­тич­ной и чет­вер­тич­ной струк­ту­ры бел­ков.