Дисбактериоз, нормофлора кишечника и применение пробиотиков

Микробная популяция у ящериц с ферментацией в толстом кишечнике в основном состоит из различных бактериальных комменсалов (как факультативных, так и облигатных анаэробов) и некоторых грибов. Кроме того, у диких ящериц, как правило, присутствуют протозойные комменсалы нескольких родов и различные виды оксиурат (представителей семейств Oxyuridae и Atractidae). Роль полезных комменсалов заключается в ферментативном гидролизе целлюлозы и синтезе некоторых незаменимых аминокислот, витаминов группы В, витамина К и летучих жирных кислот, из которых наиболее важными для игуан являются ацетат, пропионат и бутират. Важным условием для гидролиза целлюлоз является нейтральная среда (рН в пределах 6-8), так как в более кислых условиях целлюлаза-позитивные микроорганизмы существовать не могут. В желудке у игуан среда очень кислая, рН порядка 1,5 (Troyer, 1984). В подвздошной и ободочной кишках рН около 7,5, в фекалиях практически нейтрален. В кишечнике рН среды поддерживается за счет буферных веществ слюны и удаления (всасывания) конечных продуктов ферментации, особенно ЛЖК. У всех растительноядных животных в различных отделах ЖКТ содержится не одинаковое количество бактерий. Так, в желудке и верхнем отделе тонкого кишечника у большинства видов млекопитающих содержится небольшое количество микроорганизмов – а пределах 10³ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц). В нижнем отделе тонкого кишечника содержится порядка 10⁵-10⁶ КОЕ/мл, а в проксимальной ободочной и слепой кишках – до 10¹² КОЕ/мл. У игуан в 1 г содержимого ободочной кишки находится около 10¹⁰ КОЕ/мл. Видовой состав микроорганизмов у растительноядных животных может быть очень разнообразным (более 1000 видов), но, как правило, представлен 20-30 видами-доминантами, формирующими экосистему кишечника и существующими в состоянии динамического равновесия и относительного симбиоза, при котором конечные продукты метаболизма одних видов становятся субстратом для других. Их можно условно разделить на две большие группы. К первой относятся полезные виды, в основном продуцирующие молочную кислоту. Ко второй – условно-патогенные виды, при определенных условиях способные вызывать заболевания кишечника. Химическая селекция происходит благодаря ингибирующим агентам (лигнины, жирные кислоты, желчь, лизоцим, лизолектин). Механическая селекция вызвана эвакуацией химуса вследствие перистальтических движений. Избежать механической эвакуации бактерии могут двумя способами: прикрепляясь к эпителиальным клеткам или при высокой скорости размножения. В результате этих двух противоположных процессов в ЖКТ формируется комплексная микрофлора, стабильность которой определяется устойчивостью организма к нарушениям процессов всасывания воды, электролитов, питательных веществ и к некоторым инфекциям (так называемая колонизационная резистентность).

Исследования показывают, что игуаны могут иметь самую разнообразную микрофлору, которая варьирует в зависимости от условий среды и рациона. К настоящему времени исследования кишечной нормофлоры игуан ограничиваются всего 4 работами, выполненными на небольшом серийном материале (от 3 до 11 особей). Zimmerman и Tracy (1989) изучали состав кишечных комменсалов методом световой бактериоскопии зафиксированных формалином образцов кишечного содержимого. Их результаты показали, что в ободочной кишке игуан количество бактерий составляло 30 ×10⁹ КОЕ/мл, причем у одних животных доминировали различные виды Clostridium spp., а у других – Leuconostoc spp. Эти виды характерны и для растительноядных млекопитающих. В других работах из кала игуан выделили представителей родов Lachnospira, Bacteroides и Lampropedia merismopedioides, но до настоящего времени у игуан так и не выявили бактерий из родов Fusobacterium и Ruminococcus (которые являются важными компонентами в системе симбиотической кишечной ферментации многих растительноядных животных). У игуан также до сих пор не обнаружены ни лактобациллы, ни бифидобактерии (McBee, McBee, 1982; Troyer, 1982).

Наиболее полное исследование кишечной микрофлоры игуан недавно провел Марк Митчелл с соавторами (Salb, Mitchell, et al, 2002). Авторы стерильно брали пробы из подвздошной и ободочной кишки у клинически здоровых игуан годовалого возраста, которых подвергли эвтаназии непосредственно перед взятием материала. Пробы были немедленно внесены в 5% овечью кровь, кровяной агар для анаэробов, среды Мак Конки, Сабуро-декстрозу, селективную среду для кампилобактера и селенитный бульон. Аэробов культивировали в течение 24-48 часов, а анаэробов – 48-72 часов при температуре 37°С. Пробы с Сабуро-декстрозой инкубировали в аэробных условиях 48-72 часа при температуре 32°С. После инкубации отдельные колонии окрашивали по Граму и субкультивировали на 5% кровяном агаре. Изоляты определяли с помощью бактериоскопии, морфологии колоний, окраске по Граму и стандартного биохимического тестирования с помощью API тест-панелей. Для определения сальмонелл применяли тест 9+20 sp. Всего авторы выделили 14 родов бактерий и дрожжей: Acinetobacter, Bacillus, Bacteroides, Campylobacter, Candida, Clostridium, Citrobacter, Enterobacter, E. Coli, Klebsiella, Pasteurella, Peptostreptococcus, Salmonella и Staphylococcus. Как следует из этих данных, большинство родов относятся к группе условно-патогенных организмов. Интересно, что в этой работе не выделили ни одного представителя родов, относящихся к группе молочнокислых бактерий (Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus), которые представляют большой интерес в контексте применения пробиотиков. Также у игуан не обнаружили и бифидобактерий, которых в настоящее время относят к актиномицетам.

Выделение и количественный учет молочнокислых бактерий в природных субстратах связаны с рядом трудностей: они не растут на простых средах, для них требуются отвары, гидролизаты, экстракты мяса, овощей, дрожжей. Они являются наиболее сложными среди различных групп микроорганизмов с точки зрения питательных потребностей. Многие формы растут очень медленно и заглушаются сопутствующей микрофлорой. Мы так и не знаем, являются ли лакто- и бифидобактерии необходимым компонентом нормофлоры кишечника у ящериц, но при этом разные авторы советуют применять для рептилий пробиотики, причем совершенно разные и в лучшем случае аннотированные для птиц, либо живые йогурты, фекалии от здоровых животных и т.д. Этот вопрос сам по себе очень интересен, но требует дальнейшей проработки.

Интерес к пробиотикам для рептилий в последнее время усилился, так как с их помощью теоретически возможна терапия и профилактика сальмонеллеза у рептилий в неволе. Кроме того, монотерапия пробиотиками – наиболее эффективное средство лечения дисбактериозов, по-видимому, не редких у рептилий и особенно у новорожденных ящериц, не имеющих контакта со средой и взрослыми животными. Формирование микрофлоры кишечника у ящериц происходит при вылуплении из яйца во время контакта с субстратом в гнездовой камере и при первой миграции. Иммунная и ферментативная системы новорожденного еще не сформированы, и организм не может самостоятельно проявлять селективное давление на общую популяцию бактерий. Поэтому новорожденные животные – основной объект для применения пробиотических препаратов. Но для этого необходимо знать количественный состав наиболее важных групп микроорганизмов, ответственных за поддержание равновесия в ЖКТ. Для этого требуются специальные и достаточно дорогостоящие исследования. При обычном исследовании на дибактериоз образцов, взятых нами от игуан (в том числе стерильным способом при операциях на ЖКТ), обычно выявляется E.coli в количестве 1-150 млн КОЕ/г, иногда с содержанием 7-20% лактозонегативных штаммов, менее 10^-7 энтерококков, а также условно-патогенных микроорганизмов (Salmonella spp., Klebsiella oxytoca, Proteus spp., Candida spp). Лакто- и бифидобактерии при стандартных разведениях (10^-7 – 10^-6) не выявляются. Поэтому заключение по любому такому анализу всегда будет одинаковым: «Снижение общего количества E.coli, бифидо- и лактобактерий, а также наличие плесневых/дрожжевых грибов и условно патогенной флоры». Вместе с тем, дисбактериоз можно диагностировать клинически и по данным не количественной бактериоскопии нативного мазка. Далее следует назначить пробиотик. По большей части, различные пробиотики для млекопитающих и птиц содержат один или несколько видов бактерий и грибков из родов Lactobacilus, Bifidobacterium, Aspergillus и Enterococcus. Важный механизм действия пробиотиков – конкурентная адгезия к энтероцитам кишечника. У лактобацилл способность к адгезии является видоспецифичной. Поэтому для приготовления пробиотиков рекомендуется использовать микроорганизмы, выделенные от того вида животных, для которых предназначен данный препарат. Так как специально для рептилий не выпускается ни один из современных пробиотиков, приходится использовать препараты для других животных. Разные авторы рекомендуют разные препараты, хотя они могут кардинально отличаться по своему составу. Так, английский птичий пробиотик Avipro (Vetark Professional), который, например, Стив Диверс рекомендует для игуан (Divers, 1995), содержит по одному виду Lactobacillus sp, Enterococcus sp и Saccharomyces sp, без указания видовой принадлежности. Пробиотик для птиц и рептилий, производимый немецкой компанией A.Albrecht, Bird Bene Bac, которым пользуемся мы, и не без успеха, содержит 4 вида лактобацилл: L.fermentum, L.casei, L.plantarum, L.acidophilus и Streptococcus faecium. Ф. Фрай рекомендует ящерицам Probiocin, пробиотик для лошадей американского производства, еще более отличающийся по составу. Другие врачи используют любые доступные пробиотики, эмпирически дозируя их для ящериц. Можно утверждать, что это не вредит животным, но вот эффект от такой терапии обычно не велик.

Конечно, нужна экспериментальная оценка эффективности таких препаратов, опять же с применением количественного бактериологического исследования в опытных и контрольных группах ящериц, но это технически не просто. Мы наблюдали клинический эффект после курса Bird Bene Bac у игуан, синеязыких сцинков, эублефаров и среднеазиатских черепах, выражавшийся в купировании диарейного синдрома и исправлении аппетита. Животные имели в нативном мазке почкующиеся дрожжевые клетки, протея или мономорфную популяцию подвижных грамотрицательных палочек. После курса пробиотика картина нативного мазка не отличалась от нормальной. Назначение больным ящерицам и черепахам лактобифадола, содержащего L.acidophilus и B.adolescens и прекрасно зарекомендовавшего себя в терапии млекопитающих, не оказывало видимого клинического эффекта. Для того чтобы эмпирическое применение пробиотиков для ящериц было более осмысленным, следует учитывать состав пробиотика и механизм действия лактобацилл в кишечнике.

Одна из главных составляющих действия пробиотиков – антимикробная активность лактобацилл, связанная с выработкой органических кислот, низкомолекулярных антибактериальных субстанций и антибиотиков, бактериоцинов и ингибиторных белков. Все животные при смене окружающей среды испытывают нарушение баланса микрофлоры и стресс. Основной тенденцией при стрессах становится уменьшение численности лактобацилл и увеличение численности коли-форм с преобладанием условно-патогенных бактерий. У всех экономически значимых групп сельскохозяйственных животных и насекомых молочнокислые бактерии являются важной доминирующей группой. При этом различие между группами внутри семейства лактобактерий обусловлены наличием ключевых ферментов гомо- или гетероферментации. Гомоферментативные лактобактерии образуют путем гликолиза главным образом молочную кислоту и небольшие количества фумаровой, янтарной кислот, углекислоты и этанола. Гетероферментативные бактерии образуют значительно больше уксусной и пропионовой кислот, этанола и углекислоты по пентозофосфатному пути (Зинченко, Панин, 2000). Учитывая характер брожения в кишечнике игуан, для них более подходят организмы из второй группы, хотя конечные продукты брожения могут значительно меняться в зависимости от условий среды кишечника. Виды лактобацилл, в большей или меньшей степени характерные для кишечника млекопитающих и человека – L.acidophilus, L.fermentum, L.salivarus. Реже встречаются L.casei и L.plantarum. У индюков в фекалиях обнаружены Streptococcus faecalis, S.equinus, L.acidophilus. Композиция некоторых пробиотиков для птиц, типа Bird Bene Bac, имеет достаточно «универсальный» состав лактобацилл. Кроме того, птичьи штаммы, по-видимому, более специфичны для рептилий, чем штаммы от млекопитающих.

На приобретение и развитие кишечной микрофлоры у животных влияют следующие факторы: излишняя или недостаточная гигиена, антибиотикотерапия и стресс. «Стерильные» условия при вылуплении цыплят вызывают обеднение нормофлоры кишечника, что усиливает риск колонизации сальмонеллами. И наоборот, несоблюдение санитарных норм на фермах и птичниках приводит к высокой заболеваемости и устойчиво неблагополучному состоянию. Пероральное введение антибиотиков мышам делает их более чувствительными к сальмонеллам, шигеллам и кандиде. При этом после обработки антибиотиками у них успешно приживаются человеческие штаммы L.acidophilus, в норме отсутствующие (Зинченко, Панин, 2000). У цыплят даже кормовые антибиотики удлиняют срок носительства сальмонелл, и их выделение с фекалиями можно остановить только дачей экскрементов взрослой птицы.

Стресс у животных вызывает секрецию АКТГ- гормонов, стимулирующих синтез глюкокортикоидов, которые усиливают выработку муцинов в ЖКТ. Постоянными симптомами стресса становятся:

- увеличение секреторной активности гипофиза, гиперфункция и гипертрофия коркового слоя надпочечников;

- инволюция лимфоидных органов, лимфо- и эозинопения;

- кровоизлияния и образование язв в ЖКТ;

- дисбаланс кишечной микрофлоры с преобладанием оппортунистических патогенов.

Все эти процессы в большей или меньшей степени проявляются у ящериц в неволе. Для родившихся в неволе рептилий более важным является обеднение нормофлоры, а для взрослых, тем более отловленных в природе – адаптационные стрессы и развитие синдрома дисадаптации. Поэтому пробиотики очень важны в зоопарковской практике. На сегодняшний день можно рекомендовать Avipro для инсталляции микрофлоры у новорожденных ящериц и Bird Bene Bac – для лечения дисбактериозов, по крайней мере, у игуан. Эти препараты, к сожалению, отсутствуют у нас в стране. Адреса в Internet, по которым их можно заказать: www.globalpets.com (Bird Bene Bac) и www.vetark.com.uk. (Avipro).