Приготовление препаратов фиксированных клеток

В процессе приготовления препаратов фиксированных клеток микроорганизмов следует выделить четыре этапа:

1. Подготовка предметного и покровного стекол.

2. Приготовление мазка.

3. Фиксация.

4. Окраска препарата.

Подготовка предметного и покровного стекол. Предметное и покровное стекло моют и обезжиривают. Подготовленное предметное стекло пинцетом кладут на стеклянный мостик, уложенный на стеклянную ванночку. Прокаленной бактериологической петлей забирают из колбы каплю стерильного физиологического раствора или стерильной водопроводной воды и помещают ее в центр предметного стекла.

Приготовление мазка. Мазок готовят из культуры микроорганизмов, выросших в пробирках или на чашках Петри. Если культура находится в пробирке, то пробирку берут в левую руку таким образом, чтобы видна была питательная среда. В правую руку берут бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и прокаливают проволочку в пламени горелки. Затем, не выпуская бактериологической петли, мизинцем и безымянным пальцем сжимают ватную пробку пробирки и извлекают ее над пламенем горелки. Петлю помещают в пробирку, охлаждают, прикасаясь к внутренней стенке пробирки, и берут небольшое количество микробной массы. Горлышко пробирки и ватную пробку снова обжигают, после чего пробирку над пламенем горелки закрывают ватной пробкой.

Микробную массу переносят в каплю воды на предметном стекле и равномерно распределяют ее легкими медленными круговыми движениями по часовой стрелке от центра к периферии. Площадь мазка не должна превышать 1-2 см². Не рекомендуется вносить в каплю воды большое количество микробной массы, так как мазок получится толстым и неудобным для исследования. Остаток микробной массы на бактериологической петле сразу же сжигают в пламени горелки.

Предметное стекло просушивают на воздухе или высоко над пламенем горелки, держа пинцетом мазком вверх. Предметное стекло нельзя интенсивно нагревать, так как бактериальные клетки в мазке могут деформироваться.

Фиксация препарата. После высушивания мазка приступа­ют к его фиксации. Основными целями фиксации являются:

1. Гибель микроорганизмов.

2. Прилипание (фиксация) микроорганизмов к стеклу для пре­дупреждения их смывания в процессе окрашивания.

3. Интенсификация процесса окрашивания, так как мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.

В зависимости от метода окрашивания применяют термичес­кую или химическую фиксацию. Термическую фиксацию осуществляют в пламени горелки. Для этого пинцетом захватывают предметное стекло мазком вверх и трижды проводят через пламя горелки. Для определения правильности фиксирования мазка предметное стекло тыльной стороной прикладывают к руке. Если стекло горячее, но не вызывает ощущения ожога, то препарат можно считать фиксированным. Перед окрашиванием препарат охлаждают на воздухе.

Химическая фиксация применяется при исследовании тонкого строения клетки, которое может нарушаться при термической фиксации. Для химической фиксации чаще всего применяют ацетон (5-7 минут), этиловый спирт (10-20 минут), жидкость Никифорова (10-20 минут), 10% раствор азотнокислого серебра (10 минут), жидкость Буэна (рец. 4) и жидкость Карнуа (рец. 5). После фиксации препарат осторожно промывают дистиллированной водой.

Окраска препарата. Существуют простые и сложные позитивные и негативные способы окрашивания. Окрашиванию могут подвергаться живые микроорганизмы (витальное или прижизненное окрашивание) и клетки убитых микроорганизмов (фиксированное окрашивание).

При позитивном окрашивании окрашиваются клетки микроорганизмов, а при негативном - поле вокруг них. Для простого позитивного окрашивания используют один из анилиновых красителей Эти красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные (табл. 4.).

Таблица4

Характеристика анилиновых красителей, используемых при

окрашивании микроорганизмов

Кислотность красителей	Цвет красителей	Наименование
Основные	Красный	Фуксин основной, гематокслин, сафранин
Синий	Метиленовый синий
Фиолетовый	Генцианвиолет, кристалвиолет
Зеленый	Янус зеленый
Черный	Индулин
Нейтральные	Красный	Нейтральный красный
Кислые	Красный	Фуксин, эозин, эритрозин
Желтый	Конго, пикриновая кислота
Черный	Нигрозин

Чаще всего используются основные красители, реже нейтральные и кислые. Из них готовят спиртовые, спиртово-водные и водные растворы.

Для окрашивания фиксированный препарат помещают на стеклянный мостик, лежащий на стеклянной кювете, и наносят на стекло из пипетки раствор выбранного красителя таким образом, чтобы он полностью покрывал весь мазок. Продолжительность окрашивания анилиновыми красителями колеблется от 1 до 3 минут. Затем мазок промывают легкой струей воды, которая смоет только лишний краситель, не адсорбированный микроорганизмами. Потом с мазка сливают остатки воды, помещают между полосками фильтровальной бумаги и подсушивают. В случае сильного намокания фильтровальной бумаги ее меняют.

В условиях школы, в экспедиционных или иных других условиях вместо растворов красителей используют красящие бумажки, предложенные А.И. Синевым. Такие бумажки имеют размер 2x2 см и пропитаны определенным красителем (рец. 6). При необходимости на высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды и кладут окрашенную бумажку. Бумажка дол­жна быть равномерно смоченной и плотно прилегать к препарату. Для простого негативного окрашивания используют жидкую тушь или конго красный. Негативное окрашивание ведут двумя путями: либо на фиксированный мазок наносят раствор красителя, дают ему высохнуть и рассматривают с иммерсией, либо каплю суспензии микроорганизмов смешивают с каплей красителя непосредственно на предметном стекле, покрывают покровным стеклом и изучают сухой системой.

Сложное окрашивание микроорганизмов используют для дифференцированной окраски отдельных структур и органоидов клетки, различных включений цитоплазмы. При сложном окрашивании используют несколько различных красителей, различные способы фиксирования и подготовки препарата. К сложным методам окрашивания микроорганизмов относят окраску по Граму, окраску спор, окраску внутриплазматических включений и др.

Метод окраски микроорганизмов по Граму основан на способности некоторых видов микроорганизмов образовывать в клеточной стенке прочное соединение генцианвиолета (кристалвиолета) с йодом. В результате последовательной обработки генцианвиолетом (кристалвиолетом) и йодом, бактерии приобретают фиолетовую окраску, не смываемую 96% этанолом или ацетоном. Такие бактерии считают грамположительными или грампозитивными. Если в клеточной стенке микроорганизмов такого прочного соединения не образуется, то краска смывается этанолом или ацетоном, в результате чего бактерии обесцвечиваются и их необходимо дополнительно докрашивать другим красителем. Эти микроорганизмы считают грамотрицательными или грамнегативными.

Отношение бактерий к окраске по Граму может меняться в зависимости от возраста культуры, условий их культивирования и состояния окружающей среды. Поэтому для определения отноше­ния микроорганизмов к окраске по Граму следует использовать молодые, суточные культуры.

Окрашивание бактерий по Граму проводят в следующей последовательности:

1. Вначале готовят мазок, который должен быть тонким и ровным, так как в толстом мазке распределение красителя будет неравномерным, что приведет к искажению результатов. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

2. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтро­вальной бумаги и пипеткой наносят 1 % спирто-водный раствор генцианвиолета (кристалвиолета) (рец. 7) и окрашивают в течение 1-2 минут. По окончании окрашивания раствор сливают и на мазок отдельной пипеткой наносят раствор Люголя (рец. 8) на 1-2 минуты. Затем препарат промывают дистиллированной водой и помещают в стаканчик с 96% этанолом или ацетоном на 20-30 секунд. В течение этого времени препарат многократно погружают в стаканчик для полного смыва красителя. После этого препарат быстро и тщательно промывают дистиллированной водой.