Фазово-контрастная микроскопия

В прозрачных, неконтрастных, однородных (фазовых) объектах световые волны распространяются без потери интенсивности и не видимы при обычном микроскопировании. Глаз человека хорошо определяет изменения длины волны и интенсивности видимого света только при исследовании непрозрачных, окрашенных (амплитудных) объектов. Проходя через такие объекты, световые волны равномерно или неравномерно ослабляются, т.е. меняют величину амплитуды. Такие объекты называются амплитудными. Обычно это фиксированные и окрашенные препараты микроорганизмов. Живые клетки вследствие высокого содержания в них воды слабо поглощают свет, поэтому почти все компоненты их прозрачны.

Фазовый контраст реализуется с помощью специального приспособления, в состав которого входят фазово-контрастный конденсор с револьверным диском кольцевых диафрагм и фазовая пластинка, имеющая форму кольца. Луч света, проходя через прозрачный объект, расщепляется на два луча: прямой и преломленный. Прямой луч, проникнув через частицу объекта, фокусируется на кольце фазовой пластинки, а преломленный луч как бы огибает частицу, не проходя через нее. Создающаяся разность фаз значительно увеличивается с помощью фазовой пластинки. Это усиливает контрастность изображения, что позволяет исследовать общий вид живых клеток микроорганизмов целиком и детали их строения.

Для работы методом фазового контраста в микроскоп уста­навливают объектив (с буквой «Ф» на корпусе) и фазовый конденсор. Револьверный диск фазового конденсора устанавливают на «0», что соответствует светлому полю обычного конденсора. Затем на предметный столик помещают препарат, фокусируют его и поворачивают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному фазово-контрастному объективу. Например, при объективе 60 на окошечке револьверного диска устанавливают цифру 60.

Для первоначальной настройки используют вспомогательный микроскоп, который устанавливают вместо одного из окуляров. С помощью центровочного устройства конденсора добиваются того, чтобы кольцевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка совместились, а в объектив проникало лишь кольцо света. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, проводят исследование препарата.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентный метод микроскопии занимает важное место в исследовании микроорганизмов. Он позволяет получить цветное изображение объекта с высокой степенью контрастности, исследовать прозрачные и непрозрачные объекты, наблюдать дина­мику развития жизненных процессов клетки и многое другое.

Люминесценцией (или флюоресценцией) называют излучение клеткой света за счет поглощенной энергии падающего на нее света. Она основана на способности ряда веществ биологического происхождения светиться под влиянием света. Молекулы этих веществ, поглощая свет, возбуждаются и через непродолжительное время возвращаются в исходное состояние.

Некоторые бактерии способны светиться (люминесцировать) собственным светом в результате интенсивных процессов окисления, протекающих у них со значительным выделением энергии. Но большинство микроорганизмов приобретает способность люминес­цировать при освещении их ультрафиолетовыми лучами после предварительной окраски специальными красителями - флюорохрома-ми. Поглощая короткие ультрафиолетовые волны, объект излучает более длинные волны видимой части спектра. Вследствие этого разрешающая способность микроскопа повышается. Это дает возможность исследовать более мелкие частицы. Чаще всего для люминесцентной микроскопии используют акридин оранжевый, аурамин ОО, корифосфин, флюоресцин, эозин Н в виде слабых (1:500 -1:5000) водных растворов.

Для успешной микроскопии необходим яркий источник света, в качестве которого используют ртутно-кварцевую лампу высокого давления. Между источником света и зеркалом микроскопа помещают сине-фиолетовый светофильтр (УФС-3, ФС-1 и др.), который пропускает только короткие и средние волны ультрафиолетового спектра. Попав на объектив, эти волны возбуждают в нем люминесценцию, которая, однако, мешает видеть свечение препарата. Чтобы увидеть люминесцирующий препарат, на окуляр микроскопа надевают желтый фильтр (ЖС-3 или ЖС-18). Этот фильтр отсекает короткие волны, не поглощенные объектом, и пропускает длинноволновый спектр флюоресценции, возникающий при прохожодении лучей через исследуемый объект.

Существуют специальные люминесцентные микроскопы, а также различные приспособления, позволяющие использовать для люминесцентной микроскопии обычные световые микроскопы. Люминесцентная микроскопия требует применения нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Для уменьшения собственной лю­минесценции к иммерсионному маслу добавляют 5-10 капель нитробензола на 1 г масла.