Требования к умениям бакалавра. 1. кинетику ферментативных реакций, влияние различных факторов на скорость реакций, определение константы Михаэлиса и ее использование в

Знать:

1. кинетику ферментативных реакций, влияние различных факторов на скорость реакций, определение константы Михаэлиса и ее использование в клинико-диагностических целях.

2. различные виды ингибирования активности ферментов.

3. использование ферментов в качестве аналитических реагентов в лабораторной диагностике.

Уметь:

Готовить образцы для анализа

Решать задачи по соответствующему разделу

Проводить качественный и количественный ферментативный анализ

Правильно выбирать оптимальный вариант для решения конкретной исследовательской задачи

Каталаза — двухкомпонентный фермент. Одним компонентом его является гематин, который представляет собой окисленную простетическую группу гемоглобина крови. Каталаза парализуется HCN, H₂S и фторидами.

Количественно определяют каталазу с помощью титрования пероксида водорода раствором КМn0₄. Реакция идет по уравнению

2KMn0₄ + 5Н₂0₂ + 4H₂S0₄ = 2KHS0₄ + 2MnS0₄ + 8Н₂0 + 50₂.

О количестве пероксида водорода, разрушенного ферментом, судят по разности объемов (мл) 0,1 н. раствора КМn0₄, израсходован­ных для титрования в контрольном и рабочем опытах.

Приготовление вытяжки из муки или другого растительного материала — на аналитических весах взвешивают по разности в мерную колбу емкостью 100 мл 2 г муки или другого хорошо измельченного растительного продукта. В колбу прили­вают дистиллированную воду, содержимое ее хорошо перемешивают, добавляют 2—3 капли толуола, доводят водой до метки и смесь настаивают 2 ч при комнатной температуре. После настаивания жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр или центрифугируют. В фильтрате или центрифугате тотчас же опреде­ляют каталазу.

Методика опыта. Отбирают четыре пробы прозрачного фильтрата или центрифугата по 20 мл каждая: две опытные и две контрольные. Контрольные пробы кипятят 5 мин (на сетке) для инактивации фер­мента.

К опытным и контрольным пробам прибавляют по 20 мл дистилли­рованной воды, по 3 мл 1%-ного раствора Н₂0₂, предварительно ней­трализованного 0,1 н. раствором NaOH, и оставляют на 30 мин при ком­натной температуре. По истечении 30 мин к пробам прибавляют по 5 мл 10%-ного раствора H₂S0₄ и оставшийся Н₂0₂ титруют 0,1 н. рас­твором КМn0₄. Об активности каталазы судят по количеству милли­граммов Н₂0₂, которое разрушилось в течение 30 мин ферментом, содержащимся в 1 г исследуемого материала.

Активность каталазы определяют по формуле АК =(а-b) 1,7/ g

где а — количество 0,1 н. раствора КМn0₄, израсходованного для титрования в контрольной пробе, мл; b — количество 0,1 н. раствора КМn04, израсходованного на титрование в рабочем опыте (1 мл 0,1 н. раствора КМn0₄ эквивалентен 1,7 мг Н₂0₂), мл; g — навеска исследуемого материала, г.

Пример расчета. Взята навеска муки 2,1675 г. На титрование в контрольной пробе пошло 12,51 мл 0,1 и. раствора КМn0₄, в опытной —9,86 мл. Количество фильтрата (20 мл), взятого для титрования, соответствует 2,1675 • 20= 0,4335 г муки. Подставляем полученные данные в формулу:

АК =(а-b) 1,7/ g

Настоящий метод широко применяют в лабораторной практике. Кроме того, известны еще газометрические методы определения актив­ности каталазы специальными приборами. В основу газометрических определений положен принцип измерения объема кислорода.