Осаждение белков солями щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание)

Соли аммония, щелочных и щелочноземельных металлов — Na₂S0₄, (NH₄)₂ S0₄, NaCl, MgS0₄ и другие нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к выпадению в осадок. Этот способ осаждения белков называют высаливанием. Высаливание — обратимый процесс. Осадки можно снова растворить в воде. Высаливанием пользуются для разделения белковых фракций, очистки белков, выделения их в кристаллическом виде.

Реактивы: а) раствор яичного белка с хлоридом натрия; б) хлорид натрия, в виде пудры; в) сульфат аммония, кристаллический, тонко растертый порошок; г) сульфат аммония, насыщенный раствор; д) сульфат магния, кристаллический, тонко растертый порошок; е) уксусная кислота, 1%-ный раствор: ж) гидроксид натрия, 10%-ный раствор; з) сульфат меди, 1%-ный раствор.

Осаждение сульфатом аммония. В пробирку наливают 2—3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сульфата аммония, последняя порция соли уже не растворяется. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.

При полном осаждении белков в фильтрате биуретовая реакция должна быть отрицательной.

Осаждение сульфатом магния или хлоридом натрием. В 2 пробирки наливают по 2—3 мл раствора яичного белка и добавляют (до получе­ния насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлористого натрия, в другую — сернокислого магния. Через 5—6 мин. в пробирках замечается выпадение осадков (глобулины). Альбумины в нейтральных растворах солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются.

Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. В фильтратах — альбумины. Фильтраты подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты — появляются осадки альбуминов. Их отфильтровывают, в фильтрате биуретовая реакция должна быть отрицательной.

Осаждение белков путем высаливания применяется в промышленности.

Осаждение белков органическими растворителями. Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) вызывают дегидратацию белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки, что понижает устойчивость белков в растворе (растворимость) и ведет к выпадению в осадок. Лучше всего происходит осаждение белков из нейтрального или слабокислого раствора, в щелочных растворах осаждение органическими растворителями затормаживается. Способствует осаждению также присутствие электролитов (например, хлорида натрия) в растворе.

Осаждение белков спиртом обратимо при условии отсутствия нагревания и кратковременном воздействие реагента.

Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) этиловый спирт (или ацетон); в) хлористый натрий, кристаллический.

В пробирку наливают 1—2 мл раствора яичного белка, добавляют немного порошка хлорида натрия и взбалтывают до растворения. По каплям приливают 4—6 мл этилового спирта, сильно взбалтывают. Через 5—8 мин. выпадает осадок белка.

Сразу же после появления осадка отливают часть содержимого пробирки с осадком в другую, добавляют несколько миллилитров дистиллированной воды. Концентрация спирта падает, а белок снова переходит в раствор.

Тепловая денатурация белков.

Свертывание большинства белков начинается уже при температуре 50—55°С. Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой происходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул. Нагревание вызывает разрыв дисульфидных связей между полипептидными цепями, что приводит к их раскручиванию и изменению конформации макромолекул. При кратковременном нагревании (при относительно невысоких температурах) денатурация может и не произойти или проявиться в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры (а особенно при кипячении) ведет к быстрому свертыванию белка.

На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и добавление электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. Сдвиги рН в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильно кислых и сильно щелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды.

Прибавление электролитов (например, хлорида натрия) ускоряет процесс коагуляции даже в кислой среде.

Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлорида натрия); б) раствор растительных белков; в) уксусная кислота, 1%-ный раствор; г) уксусная кислота, 10%-ный раствор; д) гидроксид натрия, 10%-ный раствор; е) хлорид натрия, насыщенный раствор.

В пять пробирок наливают по 1—2 мл раствора яичного или растительного белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения: раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг белковых частиц), но осадок не выпадает, так как мицеллы сохраняют одноименные заряды, что препятствует их коагуляции.

К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1 % -ного раствора уксусной кислоты и нагревают: осадок белка выпадает быстро, поскольку заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрическому состоянию.

К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5—• 8 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения: осадок не образуется, так как мицеллы белка приобрели положительные заряды, что является стабилизирующим фактором и препятствует коагуляции.

В четвертую пробирку добавляют 5—8 капель 10%-ного раствора едкого натра и нагревают до кипения: оса­док не выпадает, поскольку мицеллы заряжены отрицательно.

В пятую пробирку прибавляют 4—5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 5—6 капель насыщенного раствора хлорида натрия, нагревают до кипения — белок выпадает в осадок.