Алгоритм бактериологического исследования дифтерии

1 день

1. Микроскопия препаратов с тампона — РИФ, окраска по Леффлеру (мет.синий). Предварительный ответ.

2. Первичный посев тампоном на среду Клауберга или Бучина. Площадка сброса у края чашки и посев штрихом по всех поверхности. При выявлении бактерионосительства — посев на сектора. Термостат 37 градусов Цельсия на 18-20 часов.

2 день

1. Просмотр чашек. При замедлении роста оставляют еще на 24 часа. Отбор подозрительных колоний: R — серочерные, S — черные.

2. Выделение ЧК — пересев на скошенную свернутую лошадиную сыворотку (среда Ру-Леффлера) — термостат 37 градусов Цельсия 14 часов.

3 день

1. Просмотр ЧК — рост в виде шагреневой кожи кремового цвета. Проверка чистой культуры — приготовление препаратов и окраска по Нейссеру, метиленовым синим по Леффлеру.

2. Постановка проб:

а) на цистиназу (Проба Пизу)

б) на уреазу (Проба Закса)

в) на токсикогенность (РП в агаре)

г) на крахмал

д) посев на ряды Гисса

4 день

1. Учет результатов

а) Проба Пизу — появление почернения по месту укола — проба Пизу положительна (BL). Отсутствие изменений — проба Пизу отрицательна (дифтероиды).

б) Проба на уреазу. Отсутствие изменения цвета среды (желтая) — проба Закса отрицательна (BL). Покраснение среды — проба Закса положительна (дифтероиды и ложная BL).

в) Проба на токсикогенность. Наличие дуг преципитации — наличие экзоктоксина (BL). Отсутствие дуг преципитации — дифтероиды и ложная BL.

г) Изменение цвета среды с глюкозой и отсутствие изменений с сахарозой (BL).

Микроскопическая картина, характер роста на среде Клауберга. Положительна проба на токсикогенность, цистиназу и отрицательная на уреазу подтверждают выделение дифтерийной палочки. На биовар указывают: характер колоний на Крауберге и проба с крахмалом. Положительная проба на крахмал (его расщепление) — отсутствие изменения цвета среды — биовар гравис. Отрицательная проба на крахмал (крахмал не расщепился) — посинение среды — биовар митис.

Постановка проб:

1. Проба на токсикогенность — реакция преципитации в агаре для выявления экзотоксина выделенной культуры. Компоненты: выделенная культура, контрольная культура (токсикогенная), противодифтерийная антитоксическая сыворотка, агар Мартена. Учет через 24 часа при 37 градусах Цельсия по наличию или отсутствию дуг преципитации.

2. Проба Пизу — для выявления фермента цистиназы. В столбик среды Пизу (агар + цистин) уколом засевают выделенную культуру в термостат 37 градусов Цельсия на 24 часа. Учет — по почернению (черное облако) в месте укола.

3. Проба Закса — для выявления фермента уреаза. В пробирку с раствором мочевины и индикатором вносят бак.петлей исследуемую культуру. Учет — через 30 минут (37 градусов Цельсия) по появлению красного окрашивания.

4. Проба на крахмал — для выявления фермента диастазы. В пробирку с раствором крахмала бак.петлей вносят выделенную культуру. Через 30 минут (37 градусов Цельсия) в пробирку добавляют раствор йода. При расщеплении крахмала — цвет не изменяется. При отсутствии амилазы крахмал не расщепляется и при взаимодействии с йодом раствор синеет.