Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
Хроматография является эффективным методом разделения и анализа биологических систем и объектов окружающей среды, позволяющим разделять смесь практически любых веществ. Основоположником хроматографического метода и самого термина "хроматография" (от греч. chroma - цвет, grapho - пишу) является русский ботаник М. С. Цвет, который еще в 1903 г. использовал этот метод для анализа и разделения хлорофилла.
Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на многократно повторяющихся процессах сорбции и десорбции разделяемых веществ между подвижной и неподвижной фазами, что приводит к различию в скорости движения этих веществ относительно неподвижной фазы.
Хроматографирование анализируемой смеси возможно при соблюдении следующих требований:
- разделяемые вещества должны иметь различные константы сорбции по отношению к подвижной и неподвижной фазам;
— неподвижная фаза должна быть такой, чтобы процессы
сорбции разделяемых веществ на ней были обратимы.
Сущность разделения веществ при хроматографировании заключается во введении разделяемой смеси из веществ X, Y, Z в хроматографическое устройство, содержащее неподвижную и подвижную фазы. В соответствии с законами термодинамики и
Рис. 26.9. Схема хроматографического разделения смеси веществ
сорбсорбционного равновесия каждое вещество смеси будет распределяться между контактирующими фазами в соответствии с его сродством к этим фазам (рис. 26.9).
Эти вещества будут перемещаться подвижной фазой вдоль неподвижной с разными скоростями. Чем больше сродство вещества к неподвижной фазе и меньше к подвижной фазе (вещество ), тем меньше скорость его движения с подвижной фазой относительно неподвижной. Обратная картина будет наблюдаться для вещества . Эти различия в свойствах веществ с течением времени обусловят их разделение в хроматографическом устройстве и приведут к появлению на неподвижной фазе отдельных зон, содержащих практически чистые разделяемые вещества. Таким образом, чем больше разница в сорбционной способности разделяемых веществ к подвижной и неподвижной фазам, тем больше разница в скоростях их перемещения по неподвижной фазе и тем полнее их разделение.
Хроматографическая методика разделения веществ состоит из следующих этапов: 1) выбор и подготовка используемых образцов подвижной и неподвижной фаз; 2) нанесение анализируемой смеси на неподвижную фазу и введение подвижной фазы; 3) собственно хроматографирование, т. е. разделение веществ при движении подвижной фазы относительно неподвижной; 4) детектирование веществ, т. е. обнаружение местонахождения разделенных веществ на неподвижной фазе или в подвижной фазе после прохождения ее через неподвижную фазу; 5) количественное определение содержания веществ в разделенных зонах.
Эффективность хроматографического процесса зависит:
1) от физико-химических свойств неподвижной и подвижной фаз;
2) от сродства разделяемых веществ к контактирующим фазам;
3) от условий хроматографирования (скорости движения подвижной фазы, температуры, времени разделения).
Изменяя эти параметры, можно подобрать такие условия, которые позволят достигнуть разделения веществ с очень близкими физико-химическими свойствами, например изомеров.
Классификация хроматографических методов. В зависимости от рассматриваемого признака хроматографического процесса различают следующие виды хроматографии.
По цели проведения:
— аналитическая хроматография используется для качественного и количественного анализа смеси веществ;
- препаративная хроматография предназначена для выделения из смеси чистых компонентов или для очистки вещества от примесей.
Рис. 26.10. Схема газового хроматографа (а) и хроматограмма разделяемой смеси веществ (б)
В газовой хроматографии подвижной фазой является газ, который называется газ-носитель, а неподвижной фазой - твердый гранулированный адсорбент или нелетучая жидкость, нанесенная на твердый носитель. Неподвижная фаза находится в колонке, а в случае капиллярной колонки роль неподвижной фазы выполняют ее стенки. Газовую хроматографию применяют для разделения летучих термически устойчивых веществ с молекулярной массой до 200-300.
Для проведения газовой хроматографии используют хроматограф (рис. 26.10). Анализируемая смесь вводится в испаритель, а оттуда с помощью газа-носителя попадает в колонку с неподвижной фазой, помещенную в термостат. Различные компоненты смеси перемещаются газом-носителем вдоль колонки с разными скоростями из-за разного сродства их к неподвижной фазе. Поэтому разделяемые вещества выходят из колонки в разное время и по отдельности регистрируются детектором, который передает сигнал самописцу. В результате получается хроматограмма, представляющая собой несколько пиков, число которых зависит от числа присутствующих в смеси веществ, а площадь каждого пика пропорциональна содержанию соответствующего вещества. Идентификация вещества проводится по времени удерживания, которое сравнивают со временем удерживания эталона при его хроматографировании на данной колонке при аналогичных условиях. Определение количественного состава смеси выполняют, анализируя площадь полученных пиков для всех веществ, а относительное содержание каждого компонента равно отношению площади пика этого компонента Si к сумме площадей пиков всех компонентов смеси:
В жидкостной хроматографии подвижной фазой является жидкость, как чистая, так и смесь разных жидкостей. Неподвижной фазой является твердый гранулированный адсорбент или тонкий слой жидкости, нанесенный на твердый носитель или содержащийся в нем. Жидкостная хроматография пригодна для разделения органических и неорганических веществ, включая и термически неустойчивые, а также веществ с большой молекулярной массой.
По применяемой технике эксперимента жидкостная хроматография в зависимости от размещения неподвижной фазы делится на плоскостную (тонкослойную или бумажную) и объемную (колоночную).
В тонкослойной хроматографии (ТСХ) в качестве твердой фазы используются силикагель (nSi02 • mН2О), оксид алюминия (AI2O3), целлюлоза или другие полимеры, которые наносятся тонким слоем на пластинку (рис. 26.11, а). Вблизи нижнего края пластинки на слой сорбента наносят пятно анализируемой смеси, а рядом по горизонтали - пятна известных соединений-свидетелей. После высыхания пятен пластинку опускают в закрывающуюся камеру с подвижной фазой, которая поднимается по пластинке за счет капиллярных сил. Вместе с подвижной фазой по неподвижной фазе перемещаются нанесенные вещества, причем с разными скоростями, зависящими от их сорбционных свойств. Когда фронт подвижной фазы поднимется к верхнему краю пластинки, ее вынимают из камеры, высушивают, и, если анализируемые вещества не окрашены, то хроматограмму проявляют. Для этого хроматограмму или опрыскивают окрашивающим реагентом, или облучают ультрафиолетовым светом, или окрашивают, выдерживая в парах иода. При проявлении на хроматограмме в местах нахождения анализируемых веществ появляются пятна.
На рис. 26.11, б представлена тонкослойная хроматограмма, полученная при разделении смеси из трех веществ X, Y, Z. Для идентификации веществ используются соответствующие соединения-свидетели, а также значения фактора относительного
Рис. 26.11. Тонкослойная хроматография (а) и хроматограмма разделяемой смеси веществ (б)
удерживания Rf, представляющего собой отношение пути h(Х), пройденного веществом, к пути, пройденному подвижной фазой h(Ф) от линии старта до линии фронта:
Фактор относительного удерживания зависит от природы анализируемых веществ, природы подвижной и неподвижной фаз, от условий хроматографирования. При одинаковых условиях анализа фактор относительного удерживания является величиной, позволяющей идентифицировать компоненты смеси при помощи соединений-свидетелей.
Количественный анализ разделяемых веществ проводят путем измерения оптической плотности пятна, образующегося при взаимодействии определяемого вещества с цветообразующим реагентом. Тонкослойная хроматография не требует сложной аппаратуры, проста в исполнении и дает надежные результаты при наличии соответствующих свидетелей. Тонкослойная хроматография включена в качестве стандартного метода анализа лекарственных препаратов в Государственную фармакопею России.
Наряду с тонкослойной хроматографией широко используется бумажная хроматография, которая по технике исполнения близка к ТСХ и так же проста. В бумажной хроматограмме неподвижной фазой является вода, входящая в состав бумаги.
Колоночная хроматография широко используется для количественного разделения смесей. В этом случае в верхнюю часть колонки с сорбентом наносят анализируемую смесь и через слой сорбента медленно пропускают подвижную фазу. Этот процесс называют элюированием. Из-за разных сорбционных свойств каждый компонент смеси имеет свое время удерживания, т. е. время прохождения через колонку. Последовательные порции элюента собирают в отдельные емкости, испаряют подвижную фазу, и получается чистый компонент.
В последнее время широкое применение для анализа нелетучих веществ находит высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая осуществляется с помощью специального хроматографа. В отличие от газовой хроматографии в этом случае через колонку с неподвижной фазой под давлением пропускается жидкая подвижная фаза. В остальном ВЭЖХ подобна газовой хроматографии.
По механизму разделения веществ хроматографию подразделяют на адсорбционную, распределительную (абсорбционную), ионообменную, молекулярно-ситовую и биоспецифическую (аффинную).
В адсорбционной хроматографии вещества разделяются благодаря различию их констант адсорбции в системах газ - твердый адсорбент или жидкость - твердый адсорбент.
В распределительной хроматографии разделение веществ происходит вследствие различия констант распределения при абсорбции веществ из газовой или жидкой подвижной фазы жидкой неподвижной фазой, которая обычно нанесена тонким слоем на твердый носитель.
В ионообменной хроматографии разделение ионов основано на различии их констант ионного обмена между раствором и ионитом.
В молекулярно-ситовой хроматографии (устаревшее название — гель-фильтрация) разделение смеси веществ происходит вследствие различий в размерах их частиц. В качестве неподвижной фазы в этом случае используют вещества, имеющие поры строго определенного размера. К ним относятся цеолиты, декстриновые гели (сефадексы), гели агарозы (полисахариды из агар-агара), полиакриламидные гели. Молекулярно-ситовую хроматографию в основном используют для выделения и очистки белков, нуклеиновых кислот и даже клеток (эритроцитов, лимфоцитов).
Биоспецифическая хроматография основана на уникальной способности некоторых биологических субстратов избирательно взаимодействовать с определенными веществами, например фермента с субстратом, антигена с антителом, гормона с рецептором, благодаря чему достигается их эффективная очистка.
Хроматография широко применяется в медицине и биологии для идентификации веществ, а также для решения большого числа исследовательских, диагностических, клинических, токсикологических задач. Качественный и количественный анализ крови или мочи на присутствие в ней алкоголя, наркотиков, допинга осуществляется с помощью хроматографии за несколько минут. Для диагностики заболеваний желчного пузыря, печени, нарушений сердечной деятельности, заболеваний центральной нервной системы, сахарного диабета, гипертонической болезни определяют хроматографическим анализом качественный состав и количественное соотношение жирных кислот в определенных физиологических средах. В гигиене и санитарии хроматография используется для контроля окружающей среды.
Дата публикования: 2014-10-16; Прочитано: 3944 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!