Определение кинетических параметров, KM и Vmax, реакции гидролиза ацетилтиохолина под действием ацетилхолинэстеразы

1. В пяти пробирках в соответствии с приведенной ниже таблицей готовят разведения ацетилтиохолина (исходная концентрация 10 ^–3 М):

№ пробирки (разведения)	Концентрация АТХ, мМ	V АТХ , мл	V буфер*), мл
	0,5
	0,4	0,8	1,2
	0,2	0,4	1,6
	0,1	0,2	1,8

^*) – 0,1 М натрий-фосфатный буфер рН 7,40 (далее – «буфер»)

2. В фотометрическую кювету вносят:

0,5 мл мембран эритроцитов,

0,2 мл буфера;

0,5 мл реактива Эллмана.

Смесь тщательно перемешивают.

3. Затем, по секундомеру, в кювету при тщательном перемешивании добавляют 0,5 мл раствора АТХ из пробирки №1 (см. таблицу).

4. Кювету помещают в спектрофотометр и через 10 секунд после внесения АТХ обнуляют значение оптической плотности при 412 нм.

5. Регистрируют изменение оптической плотности при 412 нм в течение 2 мин с интервалом 20 секунд (9 точек).

6. Для разведений субстрата в пробирках №2, №3, №4 и №5 (см. таблицу) манипуляции повторяют согласно пунктам 2-5.

7. Полученные данные заносят в таблицу.

t, секунды	Оптическая плотность, А412
Разведение №1	Разведение №2	Разведение №3	Разведение №4	Разведение №5

8. Результаты измерений отражают графически в виде зависимостей оптической плотности от времени, характеризующих кинетику данной ферментативной реакции при разных концентрациях субстрата (все пять графиков строят на одних координатных осях).

9. Затем строят график зависимости скорости данной ферментативной реакции от концентрации субстрата. Скорость реакции выражают в значениях оптической плотности от концентрации АТХ (то есть для каждого разведения), полученных в один и тот же промежуток времени. Для построения графика используют значения оптической плотности, полученные через 60 секунд от начала реакции. График строят в соответствии с ниже приведенной таблицей:

№ разведения	Концентрация АТХ, мМ	Данные для построения графика по уравнению Михаэлиса-Ментен	Данные для построения графика Лайнуивера-Берка
Конечная концентрация АТХ (в кювете), мМ	А412 при t=60 c	1/[АТХ]*)	1/А412
	0,5
	0,4
	0,2
	0,1

*⁾ – [АТХ] – конечная концентрация АТХ.

10. Полученную зависимость преобразуют в координатах Лайнуивера-Берка в соответствии с таблицей, и рассчитывают значения K_M и V _max, характеризующие гидролитическое расщепление АТХ под действием ацетилхолинэстеразы.