Специфичность действия амилазы

1. В одну пробирку вносят 2 мл 0.25%-ного раствора крахмала, во вторую – 2 мл 2%-ного раствора сахарозы. Затем в пробирки добавляют по 1 мл разведенного препарата амилазы слюны и перемешивают содержимое.

2. После инкубации в термостате при температуре 38-40°С в течение 10 мин пробирки охлаждают и определяют в них содержание глюкозы по реакции Троммера:

- для определения содержания глюкозы из каждой пробирки отбирают по 3 мл раствора;

- добавляют по 1 мл 10% раствора NaOH и по 5 капель 1% раствора CuSO₄;

- пробирки нагревают до появления окраски;

- наличие окрашивания свидетельствует о присутствии глюкозы в анализируемой пробе.

3. Полученные результаты представить в виде следующей таблицы:

№ пробирки	Субстрат	Проба Троммера
1.	Крахмал
2.	Сахароза

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические материалы по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Оформить результаты в виде графиков и таблиц.

4. Сделать выводы по каждому из опытов

Лабораторная работа № 6

Тема:	Кинетика ферментативных реакций. Ингибиторный анализ
Цель работы:	Определение основных кинетических параметров, ферментативных реакций – константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции. Определение характера ингибирующего действия сульфата меди на скорость реакции расщепления крахмала.

Оборудование и материалы:

· Спектрофотометр Solar PV 1251B

· Кюветы стеклянные

· pH-метр

· Мешалка магнитная

· Якоря магнитные

· Термостат

· Пробирки

· Штативы для пробирок

· Цилиндры мерные на 10 мл и 100 мл

· Стаканы стеклянные градуированные на 10 и 100

· Колбы на 100-250мл

· Стакан на 300 мл

· Автоматические микропипетки

· палочки стеклянные

· Бумага миллиметровая

Реактивы:

· Амилаза бактериальная

· Крахмал, 0.25% раствор

· Ацетилтиохолин йодид

· Ацетилхолин бромид

· Дитиобиснитробензойная кислота

· Бикарбонат натрия

· Гуинидин сульфат

· Раствор Люголя (йод, 1% раствор в KJ, 2,5%)

· Сульфат меди (CuSO₄), 2% раствор

· Хлорид натрия (NaCl), 1% раствор

· Вода дистиллированная

Теоретическое часть

Кинетика ферментативных реакций

Уже в ранних исследованиях по влиянию концентрации реагента на скорость ферментативных реакций была обнаружена очень важная особенность ферментативного катализа, которая заключается в сложном характере кинетики этих реакций. Так, при низких концентрациях реагента (или субстрата) реакция протекает в соответствии с уравнением первого порядка. При высоких концентрациях субстрата скорость перестает зависеть от концентрации и, таким образом, реакция в этих условиях протекает в соответствии с уравнением нулевого порядка. Общий вид зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при такой двухступенчатой кинетике приведен на рис. 6.1. При высоких концентрациях субстрата весь фермент оказывается связанным с субстратом, и скорость реакции будет максимальной. Другими словами, в реакциях, катализируемых ферментами, стадией, определяющей скорость процесса, будет стадия распада комплекса на фермент и продукт.

Рис. 6.1

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Итак, начальная скорость ферментативной реакции, обозначенная на рис. 6.1 символом V ₀ (скорость, измеряемая за период, когда израсходована небольшая часть субстрата) увеличивается по мере роста концентрации субстрата в реакционной смеси. При неизменности остальных условий (концентрации фермента [ Е ], концентрации кофакторов, температуры, значения рН) это увеличение начальной скорости ферментативной реакции, в зависимости от концентрации субстрата происходит до тех пор, пока не наступит состояние насыщения фермента субстратом. Скорость реакции, измеренная в условиях насыщения, уже не зависит от дальнейшего повышения концентрации субстрата. Она достигает максимального значения, называемого максимальной скоростью реакции, V_max, которая далее остается постоянной.

В ферментативной кинетике обычно используют значительный молярный избыток субстрата по сравнению с концентрацией фермента. Например, если фермент с молекулярной массой 100.000 взаимодействует с субстратом с молекулярной массой 100 и оба компонента присутствуют в реакционной смеси в концентрации 1 мг/мл, каждый, то на один моль фермента будет приходиться 1000 молей субстрата. В клетке наиболее реальными являются следующие численные значения концентраций фермента и субстрата: [ E ] = 0,1 мкг/мл = 10 ^{– 9 М, [} S ] = 0,1 мг/мл = 10 ^{– 3 М, т.е. молярный избыток субстрата по отношению к ферменту составляет величину, равную 106}. Даже при уменьшении [ S ] в 100 раз, его концентрация все еще будет 10.000-кратно превышать концентрацию фермента.