Зависимость скорости ферментативной реакции от количества фермента

1. В четырех пробирках готовят разведение раствора амилазы слюны по следующей схеме:

- В первую пробирку вносят 2 мл исходного раствора амилазы слюны (разведение в 20 раз), во все остальные пробирки добавляют по 1 мл дистиллированной воды;

- 1 мл раствора из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивают (разведение амилазы в 40 раз);

- 1 мл раствора из второй пробирки переносят в третью пробирку, перемешивают (разведение амилазы в 80 раз);

- 1 мл раствора из третьей пробирки переносят в четвёртую пробирку, перемешивают (разведение амилазы в 160 раз);

- Из четвертой пробирки отбирают 1 мл раствора и отбрасывают.

2. В каждую из четырех пробирок вносят по 1 мл фосфат-цитратной буферной смеси рН 6,8.

3. В первую пробирку добавить 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала.

4. В каждую последующую пробирку, кроме пятой (контрольной), добавление 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала осуществляют строго по секундомеру через 3 минуты.

5. В пятую пробирку (контрольная проба) вносят 1 мл фосфат-цитратной буферной смеси рН 6,8 и 1 мл дистиллированной воды.

6. Пробирки немедленно помещают в термостат. Каждую пробу инкубируют при температуре 38-40°С в течение 10 мин.

7. В первую и пятую пробирки добавляют по одной капле раствора I₂ и определяют оптическую плотность растворов при l = 620 нм.

8. Затем через каждые 3 минуты по секундомеру добавляют в последующие пробирки по одной капле раствора I₂ и определяют оптическую плотность растворов относительно контрольной пробы.

9. Результаты опыта представляют графически, откладывая по оси абсцисс относительную концентрацию амилазы, а по оси ординат значения относительной оптической плотности раствора при l = 620 нм.