Уравнение Михаэлиса-Ментен

Важнейшим фактором, определяющим скорость ферментативной реакции, является концентрация реагирующих веществ, концентрация субстратов. Как было указано выше, фермент взаимодействует с субстратом с образованием фермент-субстратного комплекса. Затем фермент-субстратный комплекс распадается с образованием продукта реакции, а катализатор остается в исходном состоянии. Ниже приведено уравнение, отражающее процесс ферментативного катализа с образованием продукта реакции:

Как видно из этого уравнения, фермент Е взаимодействует с субстратом S с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Этот процесс характеризуется константой скорости – k ₁. Комплекс ES способен распадаться на исходные компоненты – Е и S с константой скорости k_{− 1}. Константа k₂ представляет собой константу скорости распада комплекса ES с образованием продукта реакции.

Вполне очевидно, что фермент-субстратный комплекс способен к обратимой диссоциации в соответствии с уравнением:

Исходя из закона действующих масс, скорость образования комплекса ES можно записать следующим образом:

,

где k ₁ – константа скорости реакции образования комплекса ES.

Поскольку комплекс ES способен диссоциировать без образования продукта реакции скорость распада комплекса ES можно выразить уравнением:

,

где k_{− 1} – константа скорости реакции распада комплекса ES.

При равенстве скоростей V ₁ и V ₂ получим выражение:

Разделив обе части уравнения на величину k₁, получим: [ E ][ S ] = k₋₁ / k₁ [ ES ], где k₋₁ / k₁ представляет собой величину называемую константой диссоциации – K _S.

После соответствующего преобразования выражение приобретает вид:

В последнем уравнении величину [ E ] можно представить как [ E ₀]–[ ES ], что представляет собой концентрацию свободного фермента за вычетом концентрации фермента, связанного с субстратом [ ES ]. Величина [ E ₀] – общая концентрация фермента в начале реакции. Подставив в предыдущее уравнение вместо [ E ] – [ E ₀]–[ ES ] получим:

После преобразования последнего уравнения получаем:

Максимальная скорость ферментативной реакции достигается в ситуации, когда концентрация комплекса ES равна начальной концентрации фермента Е ₀ т.е. [ ES ] = [ E ₀]. Таким образом, можно записать следующее выражение:

Поскольку из предыдущего выражения следует, что:

то получаем:

или

Последнее уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен. Графически зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции отображает рис. 6.1. Из этого рисунка видно, что при низких концентрациях субстрата реакция характеризуется первым порядком, а при его высоких концентрациях становится реакцией нулевого порядка, когда скорость реакции становится постоянной величиной.

Следует, однако, помнить, что уравнение Михаэлиса-Ментен справедливо только для начального времени реакции, когда присутствует избыток субстрата и образуется небольшое количество продукта. Именно поэтому уравнение Михаэлиса-Ментен носит несколько ограниченный характер, поскольку оно учитывает только первую часть процесса и не учитывает его вторую стадию – влияние продукта реакции и его взаимодействие с ферментом. В связи с этим Холдейном и Бриггсом было предложено усовершенствованное выражение уравнения Михаэлиса-Ментен:

,

где К_M – константа Михаэлиса, которая равна концентрации субстрата (выраженной в молях/литр), при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. Численное значение константы Михаэлиса может быть выражено следующим образом:

Преобразованное Холдейном и Бриггсом уравнение Михаэлиса-Ментен, которое имеет вид

описывает поведение многих ферментов при измене­нии концентрации их субстратов. Используя это урав­нение можно рассмотреть несколько ситуаций, отражающих влияние [ S ] и К_M на начальную скорость фермента­тивной реакции:

1. Значение [ S ]намногоменьше величины К_M (рис. 6.1). В этом случае величину [ S ] в знаменателе можно опу­стить, и он будет практически равен величине К_M. Отношение двух постоянных величин – V _max и К_M, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:

;

(@ означает «примерно равно»).

Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже величины К_M – начальная скорость реакции, V ₀, пропорциональна концентрации субстрата [ S ];

2. Значение [ S ]намногобольше величины К_M (рис. 6.1). Тогда величиной К_M в знаменателе можно пренебречь, т.е.

;

Это означает, что при концентрации субстрата [ S ], намного превышающей К_M, начальная скорость V ₀ рав­на максимальной скорости – V _max;

3. Наконец, при равенстве величин [ S ] и К_M (рис. 6.1) в знаменателе уравнения Михаэлиса-Ментен получим удвоенное значение [ S ].

;

Это означает, что при концентрации субстрата, равной К_M, начальная скорость реакции V ₀ составляет половину максимальной скорости – V _max.

Графическое определение константы Михаэлиса (К _m)

Графически константа Михаэлиса может быть представлена, как это показано на рис. 6.1. Однако в случае многих ферментов определение V _max и К_M непосредственно из графика зависимости V ₀ от [ S ] (рис. 6.1) оказывается затруднено. Для большего удобства уравнение Михаэлиса-Ментен было преобразовано Лайнуивером и Берком в координатах двойных обратных величин:

Правую часть уравнения представляют в виде суммы двух слагаемых:

Упростив уравнение, получаем:

Как можно видеть, это уравнение представляет собой уравнение прямой:

у = ах + b,

где у = 1/ V ₀ и х = 1/[ S ].

Если построить график зависимости у (т.е. 1/ V ₀) от х (т.е. 1/[ S ]), то длина отрезка b, отсекаемого на оси у, будет равна 1/ V _max, а тангенс угла наклона – а равен величине K_M / V _max. Длину отрезка, отсекаемого на оси х (в области отрицательных значений), можно получить, приравняв к нулю. Тогда получим:

График уравнения Михаэлиса-Ментен в обрат­ных координатах называют графиком Лайнуивера-Берка (рис. 6.2). Используя его, величину K_M можно определить либо по наклону прямой и длине отрезка, отсекае­мого на оси у, либо по длине отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений на оси х. Поско­льку [ S ] измеряют в молях/литр, K_M имеет ту же размерность. Скорость V ₀ мо­жет быть выражена в любых единицах, поскольку K_M не зависит от [ E ]. ГрафикЛайнуивера-Берка позволяет определять K_M по отно­сительно небольшому числу точек, поэтому он часто используется для расчета этого параметра.

Рис. 6.2

График Лайнуивера-Берка в двойных обратных координатах (зависимость 1/ V 0 от 1/[ S ]), используемый для графического определения KM и V max.

Используя график Лайнуивера-Берка на прак­тике, при определении K_M, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких кон­центраций субстрата. Это происходит в тех случаях, когда измерения проводят через равные интервалы [ S ]. Чтобы этого избежать, измерения следует прово­дить при таких значениях [ S ], которые соответ­ствуют равным интервалам на оси х в обратных ве­личинах.

Еще одним вариантом линеаризации зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата является преобразование Хейнса-Вулфа. Если в уравнении Михаэлиса-Ментен в обрат­ных координатах

обе части умножить на величину [ S ], получим:

или

Рис. 6.3

График Хейнса-Вулфа в координатах [S]/ V 0 от [ S ], используемый для графического определения KM и V max.

График зависимости [ S ]/ V ₀) от [ S ] (рис. 6.3) представляет собой прямую линию, где тангенс угла наклона равен величине 1/ V _max, длина отрезка, отсекаемого на оси у, будет равна K_M / V _max, а отрезок, отсекаемый на оси х, равен величине

– K_M.

Определение K_M имеет большую практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих K_M, фермент будет работать практически с макси­мальной скоростью, поэтому максимальная скорость, V _max, будет отражать количество присутствующе­го активного фермента. Это немаловажное обстояте­льство используют для оценки содержания фермен­та в препарате. Знание величины K_M позволяет определить, какое количество субстрата следует внести в реакционную смесь для определения V _max. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое примене­ние также при анализе характера действия ингибиторов в ферментативных реакциях.