Колекції і банки генетичних ресурсів рослин. Кріобанки

Понад 80 наукових установ в Україні проводять селекцію 125 сільськогосподарських культур.

Колекції культур in vitro:

1. Що ростуть – це колекції, які періодично пересаджують (1 або 2 рази на рік на свіже поживне середовище): культивування при низьких плюсових температурах; додавання до середовища певних речовин (маніт, сорбіт, сахароза, гідразид малеїнової кислоти, абсцизова кислота – використовують для подовження терміну між пересівами), зниження атмосферного тиску, гіпоксія.

2. Кріобанки – більш сучасний метод. Кріозбереження буквально означає збереження у замороженому стані. Це складний багатоетапний процес, метою якого є необмежене тривале зберігання життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані холодового анабіозу.

Переваги:

- значно розширюється кількість об’єктів, що зберігаються;

- можна зберігати достатньо довгий строк (є культури моркви, законсервовані 20 років);

- можна піддавати кріоконсервуванню будь-які об’єкти, але для кожного свої особливості.

Методи кріоконсервування:

1) запаювання в ампули та занурення в рідкий азот. Треба захистити тканини і клітини від осмотичного стресу і механічного руйнування – це основна проблема. Для цього застосовують різні умови.

Загальні принципи:

1. Застосування кріопротекторів – речовини, що на першому етапі замороження повинні зменшити пошкодження клітин і тканин. Вимоги до кріопротекторів: найменша токсичність і оптимальний ефект (гліцерин, диметилсульфоксид – добре проникають в клітину, декстрин, поліетиленгліколь – проникають гірше). Концентрацію кожного кріопротектору підбирають індивідуально.

2. Попередня обробка клітин перед заморожуванням. Використовують пролін та інші речовини. Це значно зменшує стрес клітин.

3. Витримування певного режиму заморожування:

- повільне заморожування – швидкість поступово зменшується 0,5-1°С/хв.;

- надшвидкий – безпосереднє занурення об’єкту в рідкий азот.

4. Спеціальні заходи розморожування і рекультивування.

57. Культура ізольованих протопластів: отримання і культивування рослинних протопластів.

Ізольований протопласт – це рослинна клітина, позбавлена клітинної стінки ферментативним або механічним способом.

Культура ізольованих протопластів це один із найсучасніших методів, який використовується у генетиці, фізіології, вірусології і молекулярній біології для отримання соматичних гібридів між віддаленими у систематичному відношенні видами або у разі статевої несумісності, для отримання нових форм рослин шляхом введення у клітину чужорідного геному або його частини.

Протопласти вищих рослин можна отримувати механічним і/або ферментативним методом.

Сьогодні широко застосовується ферментативний, або хімічний метод виділення ізольованих протопластів. У цьому випадку для руйнування клітинної стінки використовуються суміші ферментів.

Ферментативний спосіб має великі переваги, бо він дає можливість отримувати значні кількості непошкоджених протопластів із будь-якого органа чи тканини, і порівняно швидкий.

На сьогодні протопласти отримують із однодольних і дводольних рослин, використовуючи листки, пагони, колеоптилі, бульби, плоди, пилок, калюсні культури.

Для виділення протопластів, як правило, використовують молоді рослини. Перевага надається рослинам, які виросли у стерильних умовах in vitro. На життєздатність ізольованих протопластів, та їхню здатність до регенерації клітинної стінки, до поділів, утворення мікроколоній впливає фізіологічний стан вихідного матеріалу, який визначається умовами культивування. Крім того, від фізіологічного стану вихідного матеріалу залежала здатність тканини до мацерації. Найкращі результати були отримані при вирощуванні рослин на середовищі зі зменшеним вмістом сахарози (0,5 %) і затемненні рослин перед виділенням протопластів. Або при вирощуванні вихідних рослин при низькій інтенсивності світла (1500 – 2000 Лк) і короткому фотоперіоді (6 г). Дослідники пояснюють збільшення кількості життєздатних протопластів тим, що при слабкому освітленні або на середовищі з низьким вмістом сахарози різко знижується інтенсивність фотосинтезу, в результаті чого зменшується вміст вільних цукрів і клітини синтезують тоншу клітинну стінку, яка містить менше пектину.

При виділенні протопластів із культури тканин (калюс або клітинна суспензія) необхідно враховувати:

1) вік вихідної тканини у циклі вирощування: краще використовувати тканину, що перебуває на стадії раннього експоненціального росту, коли у популяції значна кількість клітин, які здатні почати поділ;

2) особливості росту тканини – для виділення протопластів краще використовувати пухку, недиференційовану тканину, яка утворює невеликі агрегати клітин при культивуванні у рідкому середовищі.

Час виділення протопластів залежить від концентрації ферменту. При великих концентраціях тривалість інкубації становить 1 – 4 год, при невисоких – 12 - 20 год, оптимальні умови рН 5 – 6, температура 23 – 26 °С. Іноді необхідне слабке покачування протягом інкубації з ферментом.

Способи культивування ізольованих протопластів відповідають тим, що використовують для вирощування клітин. Протопласти культивують у рідкому і агаровому середовищах (табл.6).

Одним із прийомів культивування ізольованих протопластів у рідкому середовищі є метод рідких крапель. У цьому разі суспензію протопластів у вигляді крапель поміщають на рідке середовище в чашках Петрі. Метод забезпечує хороший газообмін. Однак при культивуванні цим способом ізольовані протопласти агрегуються у центрі кожної краплини, накопичуючись вони утворюють значні кількості фенольних та інших токсичних сполук, що заважає нормальному культивуванню протопластів.

Другий спосіб культивування ізольованих протопластів - агарова культура або метод плейтінга. У цьому випадку певний об’єм суспензії протопластів у рідкому живильному середовищі наливають у чашки Петрі, додають рівний

об’єм того ж самого середовища, яке містить 1% агару. Температура не вища 45⁰С. Чашки Петрі заклеюють парафілмом і культивують перевернутими при температурі близько 28⁰С.

Умови культивування протопластів

Середовище. Основна вимога до середовищ полягає у тому, щоб у процесі культивування не відбувалося руйнування ізольованих протопластів, бо до утворення клітинної стінки протопласти – це дуже ніжні структури, і щоб воно було оптимальним для утворення клітинами колоній.

Як правило, середовище має складатися з осмотичного стабілізатора, неорганічних сполук, джерел вуглецю, вітамінів, джерел органічного азоту і

фітогормонів.

Суттєвим фактором культивування є щільність висіву протопластів

Оптимальна щільність протопластів у культурі 10⁴ – 10⁶ пр/мл

У процесі культивування ізольовані протопласти регенерують нову клітинну стінку і перетворюються у звичайну клітину, яка культивується in vitro. Саме ця обставина робить ізольовані протопласти зручною моделлю для вивчення формування целюлозних мікрофібрил.

При перенесенні їх на агарове середовище утворюється калюс, із якого можна отримати цілу рослину. Регенерація рослин відбувається або через ембріогенез, або через утворення калюсу з подальшою індукцією морфогенезу.

58. Культура ізольованих протопластів: соматична гібридизація рослин.

Культура ізольованих протопластів це один із найсучасніших методів, який використовується у генетиці, фізіології, вірусології і молекулярній біології для отримання соматичних гібридів між віддаленими у систематичному відношенні видами або у разі статевої несумісності, для отримання нових форм рослин шляхом введення у клітину чужорідного геному або його частини.

Розробка способів індукції злиття протопластів разом з розвитком техніки культивування клітин in vitro, що дає можливість отримання ізольованих протопластів, їх культивування, утворення калюсу, а в подальшому цілої рослини, сформували новий і перспективний метод гібридизації рослин – парасексуальну, або соматичну гібридизацію.

Соматична гібридизація – гібридизація рослин в обхід статевого схрещування, при якій як батьківські клітини використовують ізольовані протопласти соматичних клітин або клітини, що культивуються in vitro.

Соматична гібридизація проходить етапи:

1. отримання протопластів - звільнення соматичної клітини від оболонки:

· механічний,

· ферментативний метод;

2. злиття протопластів – хімічні індуктори;

3. ідентифікація отриманих гібридів;

4. культивування in vitro;

5. регенерація – не обов’язковий для кожного з гібридів.

Ідентифікація

5 основних підходів до ідентифікації:

1. візуальна

2. генетична

3. фізіологічна

4. біонічна

5. асиметрична.

Цей метод дозволяє схрещувати філогенетично віддалені види рослин, які неможливо схрестити звичайним статевим шляхом, отримувати асиметричні гібриди. На відміну від статевого схрещування, де відбувається одностороннє виключення протоплазми, при соматичній гібридизації в утвореному гібриді обидва партнери мають відносно рівний цитоплазматичний статус. Злиття протопластів сприяє об’єднанню двох різних цитоплазм. У більшості випадків злиття ізольованих протопластів призводить до утворення або гібрида, або цибрида (цитоплазматичного гібрида)

Рис. 6. Схеми успадкування батьківських ядерних (кружок) і позаядерних (овал) детермінант при соматичній і статевій гібридизаціях.

На сьогодні методами соматичної гібридизації отримані внутрішньовидові (дурману, петунії та ін.), міжвидові (петунії, моркви, дурману, картоплі), міжродові (томати + картопля; арабідопсис + турнепс; дурман + красавка) та міжродиннігібриди (горох + тютюн; цибуля + тютюн). Однак у багатьох випадках гібридні рослини, отримані таким способом, в певній мірі, ненормальні. Наприклад соматичний гібрид між арабідопсисом і турнепсом, який є рослиною-монстром. Аномалії, що виникають, є результатом хромосомної незбалансованості.

Особливий інтерес становлять міжцарственні гібриди, які отримані від злиття протопластів рослинних і тваринних клітин. Описані гібриди між протопластами моркви і людини, тютюну і людини та інші.

59. Культури тваринних клітин: характеристика та властивості.

Клітинні культури — це генетично однорідні популяції клітин, що ростуть у постійних умовах оточуючого середовища. Це можуть бути штами нормальних клітин людини,тварин, рослин або тканин злоякісних пухлин.

Типи культур клітин

1. Первинно-трипсинізовані — отримують із подрібнених тканин людини та тварин шляхом їх обробки трипсином чи іншимиферментами. Витримують лише 5-10 поділів (пасажів).

2. Перещеплювані — клітини, які набули здатності до безмежного розмноження, оскільки є похідними пухлин людини та тварин.

3. Напівперещеплювані (диплоїдні) — можуть витримувати до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.

3 основних напрямки використання тваринних клітин:

1) отримання БАР;

2) культивування вірусів;

3) модельний об’єкт для вивчення біохімічних процесів.

Для того щоб визначити, який тип клітини треба брати для досліджень, потрібно:

- враховувати природу процесу, що буде досліджуватись;

- чи органна культура (зберігається міжклітинна взаємодія, досить довгий період підтримується гістохімічна і біологічна диференціація, присутні відмінності в паралелях, але кількісні дослідження ускладнюються) чи культура клітин (можна отримати велику масу клітин і проводити паралельні досліди, відстутні відмінності між паралелями);

- тканина ембріону чи доросла. Якщо використовувати тканину ембріону, зменшується ризик контамінації різними вірусами; характерний ріст і краща виживаність; клітини менше піддаються дезагрегації і краще прикріплюються до субстрату.

- нормальна чи пухлинна. У нормальної клітини обмежений строк життя на відмінну від пухлинної; пухлинні мають велику кількість сингенних хазяїв, але на пухлинні клітини не можна віднести 100% результатів.

Клітинні лінії зберігають в музеях.

60. Отримання культур клітинних тварин та сфери їх застосування.

Джерела отримання тваринних клітин:

1) елементи сполучної тканини – фібробласти

2) скелетні тканини – кістки і хрящі

3) скелетні, серцеві і гладкі м’язи

4) епітеліальні тканини: печінка, легені, молочна залоза, шкіра, сечовий міхур, нирки

5) нервової системи: гліальні клітини і нейрони

6) ендокринні: гіпофіз, наднирники

7) пухлинні клітини.

Використовують:

1) шматки органів – органна культура

2) цілі ембріони

3) подрібненні клітини

4) клітини, що отримують шляхом дезагрегації тканин за допомогою ферментів – універсальний метод.

Для отримання первиннотрипсинізованих клітин органи вилучають, поміщають у посудини з охолодженими сольовими розчинами з антибіотиками: пеніцилін 100-200 од/мл, стрептоміцин,; фунгіцидні препарати. Цей контейнер надходить у лабораторію.

Після отримання препарату відбувається дезагрегація тканин спочатку механічним способом (гомогенізатори, вібраційні установки, продавлювання через металічну сітку); далі ферментативна дезагрегація – використовують декілька ферментів: трипсин 0,1-0,3 % (при рН =8 має максимальну активність) в збалансованому сольовому розчині рН = 7,2-7,6, не містить Mg⁺²,Ca⁺². Для стерилізації використовують мембранні фільтри 0,2-0,45 мкм та γ-промені. Ще використовують колагеназу с=0,01-0,15 %, що руйнує колаген (діє на міжклітинний матрикс), проявляє активність в присутності Са⁺². Протеаза с=0,25-0,5% містить групу ферментів, об’єкт виділення – Streptomyces grisеus. Еластаза 0,05% - рідко використовується, діє на волокнисті структури, здатна переварювати еластин.

Трипсинізація

В двох варіантах:

- теплова (більше використовується);

- холодова.

Теплова трипсинізація

Подрібнену тканину заливають 0,25% розчином трипсину в співвідношенні 1:3 – 1:10, температура трипсину: кімнатна - 37^оС. Кожні 10÷30 хв. розчин трипсину зливають. Фракції, що руйнуються збирають і центрифугують. До осаду додається середовище культивування і ре суспендують, фільтрують через декілька шарів марлі.

Визначають концентрацію клітин використовуючи камеру Горяєва (оптимальна концентрація с=(2÷3­)·10⁵ кл/мл).

Розводять суспензію клітин середовищем культивування, потім розливають в посуд для культивування, поміщають в штативи горизонтально, з невеликим нахилом. Через добу клітини повинні закріпитися на поверхні, проводять макро- і мікроскопічний контроль. Спостерігають, чи змінився колір середовища, прозорість, включення (макроконтроль), мікроскопічний контроль визначає морфологію клітини, типовість колоній, цілісність моно- шару, відсутність очагів дегенерації. Якщо клітини декількома шарами ростуть– відбраковують, потрібен моношар культури.

Далі в цій культурі можна культивувати віруси, досліджувати біологічні процеси.

Холодова трипсинізація

Після першого екстрагування заливають клітини заливають розчином трипсину +4^оС і перемішують протягом ночі при +4-8^оС, але в цьому випадку знижується виживаність клітин.

Внаслідок дезагрегації отримують первинні культури, які є субстрат – залежними та утворюють моношар. Тільки пухлинні клітини можуть рости в суспензії.

Середовище для культивування ≈ 40 – 50 компонентів.

В залежності від призначення:

1) підтримуючі середовища – для підтримання життєздатних клітин, не містять сироватки взагалі або до 2,5%.

2) ростові - використовують для тривалого активного розмноження клітин. Обов’язкова складова – сироватка 5-10 %.

1) газове середовище (для дихання), звичайний атмосферний тиск є надлишковим, оптимальний Р=40 мм. рт. ст. забезпечує рівень рідини над клітинами 0,34 мм.

2) потреба в різних поживних речовинах.

3 основних напрямки використання тваринних клітин:

- 1) отримання БАР;

- 2) культивування вірусів;

- 3) модельний об’єкт для вивчення біохімічних процесів.

Застосування у біотехнології

Специфічні культури клітин є цінним джерелом гормонів та інших біологічно активних речовин. Вже зараз вони застосовуються для виробництва противірусного білку інтерферону.

Застосування генетиці

У генетиці здатність клітин до росту у культурі використовується у наступних напрямках:

§ Клонування

§ Зберігання клітин

§ Отримання мутантних клітин та робота з ними