Пошук необхідного клону

Всю бібліотеку висівають на чашку. Далі до чашки з колоніями прикладають плівку і передруковують колонії. Плівку опускають в розчин лугу і дезінфікують ДНК, плівку висушують і занурюють в розчин з зондом, зонд зв'язується з одноланцюговою ДНК.

Віджиг фрагмента - утворення комплементарних зв'язків між ДНК-ДНК або ДНК-РНК.

Блотинг по Саузерну— метод одержання спеціалізованої або повної бібліотеки генів (ДНК перед гібридизацією переносять із гелю на більш підходящу підкладку). Метод дозволяє встановити кількість копій даного гена в геномі, а також з'ясувати чи є в даному гені сайти для певної рестриктази і їхня кількість. Часто використовують для попереднього аналізу гена.

Аналогічний підхід, але стосовно РНК називається мозерен-блотингом.

Перенос білкових молекул, отриманих за допомогою гель-електрофорезу на твердій основі, називається вестерн-блотинг.

Прогулянка по хромосомі застосовується в тому випадку, коли потрібно клонувати велику ділянку генома еукаріот, або коли важко виділити клон з певним фенотипом. Потрібно знати локалізацію необхідного гена на цитологічній карті і мати зонд для будь-якого іншого гена цієї ж хромосоми.

39. Мутагенез іn vitro: делеції та інсерційні мутанти.

Делецией, или нехваткой, называется потеря некоторого участка хромосомы. Делеции обычно летальны в гомозиготном состоянии (а также в гемизиготном состоянии – если делеция произошла в Х-хромосоме). Отсюда следует, что большинство генов абсолютно необходимы для развития жизнеспособного организма. Исследование гетеродуплексных молекул, образованных ДНК мутанта и ДНК дикого типа, показало, что инсерционные мутанты содержат участки ДНК, встроенные в молекулу ДНК дикого типа. Было обнаружено, что несколько различных встраивающихся последовательностей могут вызывать мутации многих генов. Они различаются размером, но имеют некоторые общие черты строения. На концах содержатся одинаковые или почти одинаковые нуклеотидные последовательности, расположенные, однако, в обратном порядке. Кроме того, когда инсерция встраивается в ДНК-мишень, небольшой участок последоtвательности ДНК-мишени повторяется около каждого конца инсерции. Эта повторяющаяся последовательность ДНК, окаймляющая инсерцию, содержит обычно от 5 до 9 нуклеотидов. Инсерционные последовательности обладают следующими генетическими свойствами: 1. Наиболее характерная особенность-это способность перемещаться по геному. При этом происходит репликация инсерционной последовательности: исходный экземпляр остается в прежнем сайте, а копия встраивается в мишень. Сайты-мишени, куда встраиваются инсерционные последовательности, вообще говоря, почти не обладают специфичностью. Функции, обеспечивающие способность к перемещению (транспозиции), закодированы в самой инсерционной последовательности и жестко регулируются, поскольку транспозиция представляет собой редкое событие, происходящее на порядок реже, чем сами спонтанные мутации. 2. Инсерционные последовательности могут точно вырезаться; при этом происходит реверсия IS-индуцированной мутации к дикому типу. 3. В сайтах, смежных по отношению к инсерции, возникают делеции бактериальных генов (рис. 8.12). 4. В смежных по отношению к инсерции сайтах происходят инверсии бактериальных генов. 5. Инсерционные последовательности обеспечивают взаимодействие между такими генетическими элементами, как F-фактор и бактериальная хромосома. Инсерционные последовательности относительно невелики и кодируют лишь функции, необходимые для их транспозиции

40. Методи збагачення реакційної суміші продуктів лігування гібридними молекулами.

1. Можна використати електрофорез і хроматографію для відсікання певної частини фрагментів іншого розміру. Використовують, коли геном невеликий.

2. Методи ферментативної селекції:

- метод фосфатної обробки - після розрізання рестриктазою, ДНК обробляють лужною фосфатазою (щоб позбутися липких кінців). Застосовується для з'єднання фрагментів з липкими і тупими кінцями.

- розрізання ДНК вектора декількома рестриктазами - зменшують імовірність відновлення нативної структури. Застосовуються, коли необхідні не всі фрагменти вектора.

3. Методи молекулярного клонування - найбільше розповсюджені. Суть: введення молекул ДНК у реципієнтні клітини і наступна селекція клонів.

Вибір методу введення рДНК у клітини залежить:

- від природи векторної молекули

- від природи клітини хазяїна

Потрібно враховувати два основних принципи:

1. жодна із клітин не повинна одержати більше однієї рекомбінантної частки;

2. ці рекомбінантні структури повинні бути здатні до реплікації.

Якщо як вектор використана плазміда, то використовують методи трансформації та кон'югації для введення їх в клітину. Якщо використати фагові вектори, то для введення проводять інфекцію або трансфекцію.

Необхідна умова клонування - можливість поділу всіх трансформованих клітин.