Методи зʼєднання фрагментів ДНК в рекомбінантні молекули

Фрагменти ДНК, що містять гени, отримують з використанням ферментів рестриктаз. Рестриктази можуть утворювати фрагменти як з тупими, так і з липкими кінцями. Зшивання фрагментів ДНК проводиться трьома основними методами, що залежать від того, які кінці мають фрагменти ДНК.

1) Зшивання липких кінців

Найбільш простий й широко застосовуваний метод зʼєднання фрагментів ДНК – це віджих фрагментів ДНК отриманих після обробки ДНК рестриктазою, що утворює липкі комплементарні одноланцюгові кінці с подальшою обробкою ДНК лигазою. Лигаза каталізує утворення фосфодиефірних звязків між сусідніми нуклеотидами відновлюючи ковалентну непреривність ланцюга ДНК.

2) Зшивання тупих кінців (конекторний метод)

Для зшивання тупих кінців використовують термінальний фермент –дезоксирибонуклеотидилтрансферазу.До зшиваючих кінців добудовують нуклеотидні послідовності з однієї сторони полі А з іншої комплементарну цій полі Т до 3ʻ -кінців. Добудовані таким чином фрагменти змішують і віджигають. Для утворення кільцевих структур.Основна перевага методу в тому що його можна використовувати для фрагментів любої природи і не залежно від способа їх отримання.

3) Зшивання фрагментів с різними липкими кінцями

У ситуації, коли необхідно зшити фрагменти, утворені різними ендонуклеазами рестрикції, і мають різні, тобто некомплементарні один одному липкі кінці, застосовують так звані лінкери (або "перехідники"). Лінкери - це хімічно синтезовані олігонуклеотиди, що представляють собою сайти рестрикції або їх комбінацію. При використанні лінкерів повинна враховуватися необхідність дотримання правил експресії генетичної інформації. Часто в середину лінкера поміщають якийсь регуляторний генетичний елемент, наприклад, промотор або ділянка, пов'язана з рибосомою. У цьому випадку лінкери забезпечують не тільки об'єднання генів, а й зумовлюють їх експресію. Існують лінкери "тупий кінець - липкий кінець". При необхідності липкі кінці можна перетворити на тупі. Це досягається або відщепленням липких кінців з допомогою ферменту - ендонуклеази S1, яка руйнує тільки одноланцюгові ДНК, або ж липкі кінці "забудовують", тобто за допомогою ДНК-полімерази I на однониткових липких кінцях синтезують другий ланцюг. 42. Методи молекулярного клонування. Ідентифікація рекомбінантних молекул ДНК,

Методи молекулярного клонування – найбільше розповсюджені. Суть: введення молекул ДНК в реціпієнтні клітини і наступна селекція клонів.

Вибір методу введення рДНК в клітини залежить:

- від природи векторної молекули

- від природи клітини хазяїна

Треба враховувати два основних принципа

1. Жодна з клітин не повинна отримати більш однієї рекомбінантної частки.

2. Ці рекомбінантні структури повинні бути здатні до реплікації.

Якщо в якості вектора молекули використовували плазміди, то використовують методи трансформації і кон’югації для введення їх в клітину. Якщо використовувати фагові вектори, то введення проводять інфекцію або трансфекцію.

Необхідна умова клонування можливість розділення усіх трансформованих клітин. Відбір:

- для плазмід векторів: клітини висівають на агар, щоб були окремі колонії

Кожен вектор має певний селективний маркер і вони ростуть на відповідному середовищі: