Занятие 3. Детекция продуктов амплификации

Является финальной стадией ПЦР. Для детекции амплифицированных фрагментов ДНК используется метод горизонтального электрофореза в агарозном геле с использованием трис-боратного буфера. Для того, чтобы визуально обнаружить ДНК-фрагменты в трис-боратный буфер добавляют бромистый этидий^*. Это вещество способно встраиваться в двухцепочечные молекулы ДНК и флуоресцировать под ультрафиолетовыми лучами^**. Именно флуоресцирующие ДНК-фрагменты являются целью исследователя, применяющего ПЦР-метод (фото 7). При помощи цифрового фотоаппарата ДНК-фрагменты записываются и могут быть проанализированы.

^* Бромистый этидий – сильный канцероген, способный проникать через кожу в организм (рис. 4). Следует уделять особое внимание при работе с ним. Для работы с бромистым этидием используются перчатки.

Рис. 4. Химическое строение бромистого этидия

^**Ультрафиолетовые лучи опасны для глаз. Поэтому при работе с ультрафиолетовой лампой нужно избегать прямого попадания лучей в глаза и использовать защищающие глаза специальные очки или маски. Материалом для очков и масок может служить стекло с примесями окиси железа(Fe₂O₃), например, оконное стекло (0, 1 % Fe₂O₃).

Для этапа детекции продуктов амплификации используются следующие химические вещества:

1. агароза;

2. трис-боратный буфер^*;

3. бромистый этидий;

4. маркер молекулярных весов.

*Трис-боратный буфер можно приготовить самостоятельно.

Необходимы следующие химические вещества:

Трис-(оксиметил)-аминометан – 10,78 г,

Борная кислота – 5,503 г,

EDTA, pH 8.0 – 4,384 мл,

дистиллят – 86,3 мл,

бромистый этидий – 5-15 мкл (10 мг/мл).

Смешать химические вещества и размешать до полного растворения. Довести дистиллятом объем раствора до литра. Хранить трис-боратный буфер нужно при температуре 18-25 ^оС.

Порядок работы.

1. Приготовить 1.8%-ный агарозный гель на основе трис-боратного буфера. Поместить его в камеру для электрофореза.

2. Залить гель трис-боратным буфером, содержащим бромистый этидий.

3. Нанести по 5 мкл каждой пробы в отдельные лунки. Нанести в отдельную лунку маркер.

4. Подключить камеру для электрофореза к источнику электрического питания (50 mA, 100 V).

Через 30-70 минут после начала электрофореза достать гель и сфотографировать его под ультрафиолетовой лампой, используя специальные очки для защиты глаз (фото 7).

Количество наработанных фрагментов ДНК определяют качество визуальной детекции ампликонов. Сколько же нужно ампликонов одного фрагмента ДНК для визуальной детекции? Для фрагмента ДНК длиной от 100 до 200 п. н. достаточно 10^8–10⁹ двухцепочечных ампликонов. Теоретически, это приблизительно 30 циклов ПЦР на ДНК, выделенной из одной клетки.

М-маркер (длина фрагментов от 100 до 1000 п. н.; шаг– 100 п. н.),

1, 2, 3 – фрагменты ДНК дуба пушистого.

Фото 7. Продукты амплификации ДНК дуба пушистого (OPA 14)

Чем меньше длина двухцепочечного ДНК-фрагмента, тем слабее он флуоресцирует. Это объясняется тем, что в короткий ДНК-фрагмент встраивается меньшее количество молекул бромистого этидия, чем в длинный.

Бромистый этидий обладает интересной особенностью, за которую его и начали использовать в ПЦР-методе. При встраивании бромистого этидия в двухцепочечную молекулу ДНК, его способность к флуоресценции возрастает в 20 раз. Максимум спектра поглощения бромистого этидия находится в области ультрафиолетовых лучей.

Статистическую обработку данных ПЦР-анализа можно проводить при помощи различных компьютерных программ:

Treecon for Windows (version 1.3 b), MAPMAKER 3.0, Граф-анализ и др.

Задание 3.1.

Провести детекцию продуктов амплификации ДНК комнатных растений (праймеры серии OPА).

Задание 3.2.

Провести детекцию продуктов амплификации ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (специфические праймеры).