Лекция 4. Типичные ошибки при проведении ПЦР

Метод ПЦР состоит из большого числа последовательных и аккуратных действий. Способность контролировать каждый свой шаг в этом методе приходит со знаниями и опытом.

Очень важным моментом является воспроизводимость результатов ПЦР. Для того чтобы этот показатель был высоким, нужно стандартизовать условия проведения ПЦР. Условия должны быть одинаковыми для всех проб.

Рассмотрим типичные источники ошибок, встречающиеся на каждом из этапов ПЦР.

Этап выделения ДНК.

1. Неправильное хранение биологического материала.

2. Загрязнение проб.

3. Нарушение очередности действий в этапе выделения ДНК.

4. Истечение срока годности реактивов для выделения ДНК.

Этап амплификации ДНК.

1. Нарушение пропорций при смешивании реактивов для амплификации.

2. Использование праймера, не способного отжигаться на ДНК данного организма.

3. Загрязнение проб ДНК из соседних пробирок (при отсутствии смены наконечников).

4. Истечение срока годности реактивов для амплификации ДНК.

Этап детекции продуктов амплификации.

1. Использование силы тока и напряжения, неподходящих для электрофореза ДНК.

2. Неправильное подключение камеры для электрофореза (ДНК-фрагменты всегда двигаются к аноду).

3. Испорченный трис-боратный буфер. Это возможно при неправильном хранении либо при продолжительном использовании буфера.

4. Неправильное приготовление и старение агарозного геля (высокая хрупкость, сомкнутые стенки лунок и т. д.).