Занятие 2. Амплификация ДНК

Основой данного этапа ПЦР является программируемый амплификатор. Амплификатор в зависимости от стадии изменяет температурный режим пробирок и временной интервал.

Амплификация ДНК включает в себя 3 стадии*:

1. денатурация ДНК (0,5-1 минута, 93 ^оС),

2. отжиг праймеров (0,5-1 минута, 35-40 ^оС),

3. наращивание цепи (1 минута, 72 ^оС).

*Температура и продолжительность цикла подходят для праймеров серии OPA.

Рассмотрим как нарабатываются двухцепочечные фрагменты ДНК (ампликоны):

1-й цикл – 0

2-й цикл – 0

3-й цикл – 2

4-й цикл – 8

5-й цикл – 22

6-й цикл – 52 и т. д.

Каждую сумму наработанных ампликонов для любого цикла (n) можно представить в следующем виде:

1-й цикл – 2ⁿ - 2n

2-й цикл – 2ⁿ - 2n

3-й цикл – 2ⁿ - 2n

4-й цикл – 2ⁿ - 2n

5-й цикл – 2ⁿ - 2n и т. д., где n – количество циклов.

Таким образом, формула, по которой можно считать количество образовавшихся ампликонов в ходе полимеразной цепной реакции, следующая:

2ⁿ - 2n = F,

где n – количество циклов.

Количество ампликонов с каждым циклом (n) увеличивается почти в два раза. При n→ ∞ это можно записать в следующем виде:

lim (2^n-1 – 2(n – 1))/ (2ⁿ – 2n) = 1/2

n→ ∞

Для проведения данного этапа ПЦР (амплификации) используют разные приемы. Рассмотрим два из них.

1. «Горячий старт» («hot start») – прием, при котором пробирки с реагентами помещаются в амплификатор, нагретый до температуры 93-94 ^оС. Денатурация ДНК 1-го цикла должна протекать 2-2,5 минуты. Остальные циклы протекают согласно описанным выше температурным и временным константам. Данный прием позволяет избежать неспецифического отжига праймеров. Существуют разные модификации данного приема (например, с использованием воска).

2. Обычный прием предусматривает помещение пробирок в амплификатор при комнатной температуре. После достижения амплификатором температуры в 94 ^оС начинается процесс денатурации и т. д.

Для проведения этапа амплификации ДНК используются стандартные наборы реактивов. Примером может служить набор «АмплиСенс – 200 -1» фирмы «АмплиСенс» (Москва, Россия). В его состав входят:

1. смесь нуклеозидтрифосфатов, 2 mM;

2. 5-кратный реакционный буфер, без Mg²⁺;

3. сульфат магния, 50 mM;

4. деионизованная вода, стерильная, автоклавированная;

5. Taq-полимераза, 5 ед/мкл;

6. воск для ПЦР, 14%-ный, плавление при 37 ^оС;

7. минеральное масло, вазелиновое;

8. исследуемая ДНК.

Такой набор рассчитан на 200 реакций в объеме 25 мкл. Хранится набор при температуре 2-8 ^оС.

Смешивание реактивов проводится в такой пропорции (возможны вариации):

1. смесь нуклеозидтрифосфатов – 2,5 мкл;

2. 5-кратный реакционный буфер – 5 мкл;

3. сульфат магния – 1,5 мкл;

4. деионизованная вода – 3 мкл;

5. Taq-полимераза – 0,5 мкл;

6. минеральное масло – 11,5 мкл;

7. исследуемая выделенная ДНК – 5мкл;

8. праймер – 1 мкл.

Общий объем: 30 мкл.

Амплификация ДНК длится приблизительно 2,5 – 3,5 часа (30-40 циклов).

Количество праймера, необходимое для амплификации одного ДНК-фрагмента с одной молекулы ДНК в течение n циклов (рис. 2), описывается математической формулой:

P = 2ⁿ⁺¹ – 2, где n – количество циклов, а Р – количество молекул праймера (прямого + обратного).

Порядок работы.

1. Промаркировать пробирки.

2. Смешать реактивы, исследуемую ДНК и праймер в пропорции описанной выше. Процентрифугировать на вортексе в течение 1 минуты, чтобы на стенках пробирок не осталось реагентов.

3. Выбрать подходящую программу на амплификаторе, загрузить пробирки в амплификатор и запустить амплификацию.

4. По окончанию амплификации можно приступать к 3-му этапу ПЦР (детекции продуктов амплификации).

Пробирки с наработанными фрагментами ДНК можно хранить при температуре 2-8 ^оС в течение двух недель.

Задание 2.1.

Провести амплификацию ДНК, выделенной из листьев комнатных растений с использованием праймеров серии OPA.

Задание 2.2.

Провести амплификацию ДНК, выделенной из полиэдров вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда со специфическими праймерами: а) 5’- GCC GGC GGA ACT GGC CCA -3’, б) 5’- CGA CGT GGT GGC ACG GCG -3’.