Занятие 1. Выделение ДНК

Для этапа выделения ДНК используется, как правило, свежий биологический материал, в котором ДНК находится в целостном состоянии. Все факторы, которые приводят к разрыву ковалентных связей в исследуемой ДНК и загрязняют пробы чужеродной ДНК, обусловливают ошибки при проведении ПЦР и должны быть упразднены. К таковым, прежде всего, нужно отнести высокую температуру (40–50 ^оC и выше), электромагнитное излучение (ультрафиолет, рентгеновские лучи), радиационное излучение (α, β, γ-лучи), присутствие жизни на исследуемом материале (бактерии, грибы). Наиболее оптимальным местом хранения ДНК является морозильная камера. При температуре -5 – -20 ^оС ДНК в клетках может сохраняться достаточно длительное время, не разрушаясь. Для хранения материала в течение 1-2 суток используется холодильник (2-8 ^оC).

Для выделения ДНК лучше всего подходит ткань, где клетки активно делятся и растут.

Мертвая ткань и ткани опорно-трофической функции, где ДНК встречается в полуразрушенном состоянии, дают слабый выход ампликонов (фото 6).

М – маркер молекулярных весов ДНК (длина фрагментов от 100 до 1000 п. н. с шагом в 100 п. н.); О – отсутствие продуктов амплификации ДНК

Фото 6. Отрицательная ПЦР-реакция (праймер OPA 14) с ДНК, выделенной из плавников пеленгаса

Объем материала, необходимый для выделения достаточного количества ДНК, зависит от размера клеток. Чем меньше размер клеток, тем меньше необходимо исследуемого вещества. Если ПЦР состоит из 40 циклов, то теоретически достаточно и одной клетки для того, чтобы обнаружить наработанные ДНК-фрагменты. Чем меньше исследуемого материала (количества клеток), тем аккуратней нужно проводить исследование, чтобы не загрязнить пробу.

При выделении ДНК используются стандартные наборы реактивов. Например, комплект «ДНК-сорб-А» фирмы «АмплиСенс» (Москва, Россия) для выделения ДНК, который имеет следующий состав:

1. лизирующий раствор;

2. отмывочный раствор;

3. сорбент универсальный;

4. ТЕ-буфер для элюции ДНК.

Хранится набор при температуре 2-25 ^оС. Рассчитан на выделение ДНК из 100 проб.

Порядок работы.

1. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок. Промаркировать пробирки.

2. Растереть пробы в ступке с добавлением 100 мкл дистиллята и перенести пробы по отдельным пробиркам.

3. Лизирующий раствор (если он хранился при 2-8 ^оС) прогреть при 65 ^оС до полного растворения кристаллов. В пробирки добавить по 300 мкл лизирующего раствора.

4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 ^оС. Процентрифугировать 5 с при 5 тыс. об/мин на центрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс. об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

5. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 20 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, поставить в штатив (планшет) на 2 минуты, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 минут.

6. Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удалить супернатант, используя дозатор с переменным объемом и меняя наконечник для каждой пробирки.

7. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге.

8. Удалить супернатант, используя дозатор с переменным объемом и меняя наконечник для каждой пробирки.

9. Повторить отмывку еще раз, следуя пункту 8., удалить супернатант полностью.

10. Поместить пробирки в термостат при 65 ^оС на 5-10 мин для подсушивания сорбента (осадок приобретает цвет мела). При этом крышки пробирок должны быть открыты.

11. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Переместить в термостат при 65 ^оС на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

12. Процентрифугировать пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК, пробы готовы к постановке ПЦР.

Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при 2-8 ^оС и в течение 1 года при минус 20 ^оС. Эффективность выделения ДНК составляет 50-70 %.

Задание 1.1.

Выделить ДНК из листьев комнатных растений.

Задание 1.2.

Выделить ДНК из полиэдров вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда.