Лекция 1. Смысл полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР – полимеразная цепная реакция, в ходе которой амплифицируются определенные участки ДНК. ПЦР была изобретена американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 году. Широкие возможности, сравнительная дешевизна и простота ПЦР позволили использовать этот метод генетического анализа в разных областях научных исследований. В основе ПЦР лежит естественный для клеток процесс репликации (рис. 1). Отличие ПЦР от репликации состоит в том, что ПЦР происходит in vitro и воспроизводит репликацию частично.

1- геликаза

2- топоизомераза

3- ДНК-полимераза

4- ДНК-полимераза

5- лигаза

6- фрагмент Оказаки (затравка)

7- нуклеозидтрифосфаты

8- ДНК

Рис. 1. Репликация ДНК

Основные компоненты реакции:

dNTP (нуклеозидтрифосфаты), Taq-полимераза, праймеры, Mg²⁺, ПЦР-буфер, деионизованная вода, исследуемая ДНК. Полимеразная цепная реакция делится на циклы. Каждый цикл состоит из нескольких стадий: денатурация, отжиг праймеров, наращивание (комплементарное достраивание) цепи. Для каждой стадии характерны своя температура и временной интервал. Количество ампликонов разной длины, образующихся в конце ПЦР, теоретически можно рассчитать, если знать места отжига праймеров. Классическим примером является отжиг одного праймера по одному разу на каждой из цепей ДНК. Необходимо, чтобы при этом 3'-концы праймеров были впереди по отношению друг к другу (рис.1). Два двухцепочечных фрагмента (ампликона), которые появляются в конце 3 цикла в этом примере, дадут через n циклов следующее количество копий: F = 2∙2ⁿ, где F-количество двухцепочечных фрагментов ДНК, а n - количество циклов.

Рис. 2. Амплификация ДНК (окончание на следующей странице)

P – праймер, ffffffff – наращиваемая цепь, * – ампликоны

Рис. 2. Амплификация ДНК (продолжение)