Аденозинтрифосфорная кислота, как универсальный химический источник энергии в клетке

АТФ → АДФ → АМФ

расщеп. расщеп

Запасание энергии через зарядку мембраны или через молекулу.

АТФ – это небольшой, но жизненно-важный, богатый энергией нуклеотид. Молекула АТФ состоит из пурина-аденина, 5-ти С сахара, рибозы и 3 фосф. групп. АТФ – стандартная единица в виде которой запасается освобожденная при дыхании энергия. Причем вся хим. энергия представляется в форме АТФ. АТФ постоянный источник энергии для клетки. Он мобилен и может доставлять химическую энергию в любую часть клетки. Требуемая клетке энергия получается при гидролизе АТФ. АТФ универсальный носитель энергии и содержится во всех живых клетках. Располагая достаточным количеством АТФ клетка может синтезировать пит. вещества, представляющие собой одну из форм запасенной энергии, которую можно использовать при необходимости. Почти весь АТФ синтезируется ферментами за счет энергии H⁺-резервуара заключенного в мембрану. АТФ образуется и при дыхании. Недостаток АТФ это голод и смерть для клетки, поскольку клетка при наличии пит. веществ не способна их утилизировать.

60. Действие химических факторов на рост и развитие м\о. Ингибиторы и активаторы м\о.

Среди огромного разнообразия хим. в-в трудно найти такие, которые бы не оказывали на м\о никакого воздействия. Одни стимулируют рост м\о, другие угнетают его или даже приводят к гибели(антимикробные агенты).

Помимо биогенных и макроэлементами, многим микроорганизмам необходимы так называемые факторы роста. Факторами роста наз. орган. в-ва, которые м\о не способны сами синтезировать, но без которых жизнедеятельность клетки оказывается невозможной. К факторам роста относятся аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, витамины, в редких случаях – ненасыщенные жирные кислоты или стеролы.

Антимикробные агенты делятся на несколько категорий в соответствии с областью их применения: дезинфекторы, антисептики, консерваторы, химиотерапевтические препараты, антибиотики.

Дезинфекторы и антисептики. К дезинфекторам относят хим. соединения, обладающие высокой микробоцидной активностью по отношению к вегетативным клеткам и неклеточным существам, использующие для обработки неживых объектов. Под антисептиками понимают микроцидные агенты, пригодные для наружного применения при обработке поверхности кожи и слизистых оболочек с целью уничтожения патогенных м\о.

Консерванты. Это микробостатические агенты, которые ограничивают рост нежелательной микробиоты в продуктах питания, косметических средствах и др. данные в-ва в используемых конц. не должны обладать токсичными, мутагенными или канцерогенными свойствами по отношению к организму человека. Чаще всего применяемые консерваторами является поваренная соль и сахар. Их добавление в продукт уменьшает конц. свободной воды и тем самым ограничивает развитие микробиоты. Широко используются орган. кислоты: лимонная, молочная, уксусная, пропионовая, бензойная, сорбиновая, а так же их соли. Действие данных соединений основано на снижении рН продукта, что отрицательно сказывается на развитии нейтральных и алкалофильных организмов. Кроме того, многие орган. кислоты оказываются токсичными для м\о. Для консервирования фруктов, ягод, соков, вин используют сернистый ангидрид, а также жидкие сульфиты. В последнее время в качестве консервантов стали использовать бактериоциды (низин). Механизм действия бактериоцинов на клетки близкородственных огганизмов основан на повреждении плазматических мембран, нарушении синтеза ДНК, РНК и белка.

Химиитерапевтические агенты и антибиотики. К химиитерапевтическим агентам, ограничивающих рост м\о, относят синтетические соединения, которые используют для лечения заболеваний, вызванных м\о (сульфаниламидные препараты, изониадин т этимбутон, противовирусные препараты). Механизм их воздействия на м\о различны. Механизм действия большинства антивирусных препаратов основан на ингибировании активности ферментов, синтезирующих вирусные ДНК.

К антибиотикам относят пенициллин. Недавно еще причисляли лишь низкомолекулярные в-ва, синтезируемые самими м\о, с высокой избирательностью действия по отношению к определенным группам м\о. в настоящее время это определение требует корректировки, т.к.:1-появилист синтетические антибиотики, которые, правда, являются аналогами природных;2-обнаружениы антибиотики растительного и даже животного происхождения;3-найдены антибиотики, чьё действие направленно не на м\о, а на клетки злокачественных опухолей.

Главные отличительные признаки антибиотиков: небольшая молекулярная масса, очень высокая биоцидная или биостатическая активность, избирательность дествия, которая отличает антибиотики от остальных антимикробных агентов, природное происхождение.

Механизм действия антибиотиков на клетки-мишени очень сильно различается, в соответствии с чем можно выделить несколько их групп. Действие большинства антибиотиков направлено против бактерий. Среди них: нарушающие синтез клеточных стенок;ингибирующие процесс синтеза белка;нарушающие функции мембран;блокирующие синтез РНК.

61. Общая характеристика методов качественного и количественного учета м\о

Методы м\б контроля основа м\б анализа. Основное назначение обеспечение м\б безопасности пищ. продуктов. Существует 2 задачи м\б анализа:

- качественный м\б анализ (органалепт., визуальный анализ (макроанализ) и микроскопический анализ);

- количественный анализ (инструментальные): 1- анализ общего количества м\о;2- анализ видового состава м\о. Оно подразделяются на прямые и косвенные м-ды.

Прямые – дают опсолютное значение численности м\о(м-ды микроскопии, опсева в агар)

Косвенные – дают параметры(меняет электропроводность) – тоебуют провидения калибровки с использованием прямых методов.

М-ды посева на агаре: Коха, м-д исчерпывающих штрихов, м-д посева уколом, м-д Дригальского.

М-д определения биомассы взвешиванием, методика вклучает:

- взвесить сухой бумажный фильтр и бюкс

- колба Бунзена, накладывается фильтр, проводится фильтрация суспензии м.о определенного V

- фильтр помещают в стерильный бюкс и высушивают при Т= 105°С

- определяется разность масс до и после сушки N=Δ М/(Δm *М)

Δm – масса м\о среднего вида; V- фильтруемый объем; ΔМ в 10^{-4 г}

Масса 1 клетки≈10^-11г. Методом можно измерить 10^-4 кл\мл.

Метод определения микробного числа воздуха и воды

-м-д Коха, методика:

- чашку петри заливают питательным агаром и оставляют на воздухе на 5-10 мин

- закрывают чашку и ингибируют при 37°С в течении 2 суток, затем вычисляют число м\о

N=ā·100·1000·5\ b·10·t, ā – усредненное количество по всем чашкам; 100-S чашки; 1000 – коэф-т пересчета(кл\м³ в литры);10 – из этого V в-ка над чашкой→ идет осаждение из него м\о; b- S где считали число колоний.

М-д Кортова(более точный) – пропуская через определенный V воздуха через прибор с бактериальным фильтром, затем фильтр помещают на мясо-бетонный агар. Культивируют 2 суток при 30°С

N=а·1000\V (кл\м³)

Измерение ОМЧ для воды:

Измерен. в водопроводной воде 1мл. вносят в чашку петри и заливают агаром (растопленным 80°С) и дают застыть в течении 20 мин. Чашку переворачивают и ставятв термостат на 2-7 суток при 37°С.

N=ā·10^f\V кл\мл или кл\м³ ā – среднее количество колоний, которое выросло;f – разведение; V- объем, вносимый внутрь чашки(1 мл)

Прямые методы подсчета м\о используют для количественного анализа

Подсчет клеток в камере Гореева N=а·1000·n\h·S, а – среднее значение в 1 квадрате, h – высота камеры, n – разведение, 1000- коэф. Пересчета.

М-д Королева – для анализа дрожжей

Перется 2 пробирки с известным и неизвестным количеством дрожжей/ они смешиваются и м.б. предварительно одни из них окрашены, делают мазок, подсчитывают окрашенные и неокрашенные N_x=N₀·(n\m), N_x с неизвестным количеством м\о, n – количество неокрашенных, m – кол-ство окрашенных, N₀- известное количество окрашенных м\о

М-д мембранных фидьтров

Анализируемый воздух или вода пропускаются через фильтр и м\о оседают на фильтре, фильтр снимается в чашку, м\о культ-ся 3-4 часа затем рассматривается в микроскоп.

М-д агаровых капель

М-ды посева и культивирывания

Арбитральные м-ды, обладают высокой чувствительностью9можно зарегисрировать 1 клетку в 1 мл), но длительный, большой расход реактивов, трудоёмкий м-д(10-15 анализов за сутки), точность (сред ошибка 20%).

Питательные среды жидкие и твердые. Твердые агаризованные(агар-агар) и белковые(коллаген, казеин).

Для жидких сред:1 – посев петлей, вносят питлей м\о в пробирку и ставим термостат для размножения; 2- м-д разведения; 3- м-д наиболее вероятного числа – используют таблицы, чтобы определить вероятность из пробирок (100) через определенное время наблюдают помутнение, значит там есть хотябы одна клетка м\о, которая начала размножатся.

Для твердых: 1- м-д посева уколом- пробирка заливается растопленным агаром и снимают петлей м\о, прокал-ся среда. Через несколько часов смотрят, как развиваются м\о, если м\о развиваются на верху, то аэробы; если на глубине, то анаэробы; факультативные аэробы; если газообразование, то в агаре будут трицины.2 – м-д посева на скошенный агар – в пробирку на 1\3 часть заливают агар и пробирку помещают в штатив под углом, агар растекается и питлей сеется м\о. 3- м-д посева в агар (м-д Коха) – плавят агар (90°С), охлаждают на водяной бане до 50°С, добавляют 1 мл суспензии м\о на чашку и вливают агар (10-12мл) перемешивают пока не застынет агар, ставят в термостат.4- м-д Дригальского (посев на агар) – в чашку заливают растопленный агар и накрывают фильтровальной бумагой, застывает 10-15 мин, переворачивают и так хранят. Готовят суспензию м\о путем разведения и из последней отбирают 0,1 мл и наносят на чашку, и стерилизуют шпателем растирают м\о по всей поверхности агара.

Разведение необходимо, чтобы не оброзовывались ассоциаты.

5 - м-д исчерпывающего штриха- чашка заливается агаром, берут петлю м\о и делают несколько штрихлов в одном направлении, петдю стирилизуют и делают штрихи от первых. Отдельные калонии рассматривают под микроскопом

Если изучают взаимоотнашение м\о

Подсеивают культуры и ставят в термостат и через сутки наблюдают где есть рост

Стадии м-да посева и культивирования в агаризованных средах

Стадии	Жидкие	Тв. среды
1. Подготовка проб – анализ поверхности - анализ из глубины 2. приготовление разведения 3. посев 4. культивирование в термостате 5. подсчет м\о 6. оценка качества результатов измерений	- + + + + +\- +	+ + + + + + +

62. Бактериоскопические методы анализа м\о. Техника приготовления мазка и окрашивания по Граму.

Техника приготовления мазка. На чистое и обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды. В нее бактериальной петлей вносят культуру м\о, эмульгируют и полученную суспензию равномерно размещают на стекле. Препарат высушивают при комнотной температуре, затем фиксируют.

Цель фиксирования:- умертвить м\о; - зафиксировать их на стекле и тем самым уберечь от смешивания; - увеличить восприимчивость клеток к окраске.

Лучшее фиксировать нагреванием. Для этого препарат проносят 3-4 раза над пламенем спиртовки, держа мазок сверху.

Окраска бактерии по методу Грамма

Существует несколько методов окраски бактерий по методу Грамма. Наиболее часто используется следущие: полное(традиционные) и экспресс- метод.

Согласно с полным методом окраски бактерий, мазок на предметном стекле фиксируют трехразовым проведением через пламя горелки. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый р-р генциана фиолетового на 0,5 -1 минут, снимают полоску бумаги, наливают р-р Люголя и стекло прополаскивают в этиловом спирте на протяжении 0,5-1 минут, пока не перестанет отделяться краска. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают от 1 до 2 минут фуксином Цикля, который разведен(1:10) дистиллированной водой. После промывки и просушивания препората мазок микроскопируют.

Согласно с экспресс-методом, на обезжиренное предметное стекло наносят петлей одну каплю дистиллированной воды (при пригатовленни препаратов из колоний на плотных средах) или одну каплю бульонной культуры. В каплю дистиллированной воды вносят небольшое количество микробных клеток из анализируемой калонии или газона чистой культуры на плотной среде. Затем в каплю вносят петлей одну каплю реактива 1, распределяют смесь по стеклу и подсушивают мазок при комнатной температуре. Фиксируют в пламени горелки, промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и наносят реактив 2, накрывая им всю поверхность стекла на 1-5 минут(продолжительность окраски не влияет на ее результат). Тщательно и быстро прополаскивают препарат водой, просушивают фильтровальной бумагой, микроскопируют. При приготовлении на одном стекле нескольких мазков на стекло наносят восковым каранлошом линии, которые разделяют поверхность стекла на необходимое количество квадратов.