Робота № 48. Розподілення пігментів хлоропластів хроматографічним методом та визначення їх кількості у листках

Основні відомості. Уперше швидкий розподіл окремих компонентів із суміші фотосинтетичних пігментів методом адсорбційної хроматографії на колонках здійснив у 1904 р. М.С. Цвет. Пізніше виявилось, що ефективнішою є розподільна паперова та тонкошарова хроматографія. Основи її становить неоднаковий розподіл компонентів суміші між двома рідкими фазами, що не змішуються між собою. Одна з них рухома, інша, наприклад, хроматографічний папір, силікагель, силуфол – нерухома. Твердий носій утримує на своїй поверхні нерухому фазу розчинника (полярний розчинник). Функцію рухомої фази виконує неполярний розчинник. Досліджувану суміш сполук наносять на папір або на тонкошарову хроматографічну пластинку. Потім через хроматограму пропускають роздільну суміш розчинників. Унаслідок різниці в розчинності у певному розчиннику та різної адсорбції пігменти рухаються сорбентом з різною швидкістю й розташовуються на сорбенті окремими зонами. Чим більша розчинність пігменту в розчиннику і чим слабше він сорбується даним сорбентом, тим швидше буде він рухатися і тим далі від старту розташовуватиметься на носії його зона.

Мета роботи. Відокремити каротиноїди від хлорофілів і визначити їхній уміст у зелених листках.

Матеріали, реактиви, обладнання. Листки вищих рослин (пеларгонії, примули, плюща), суспензії водоростей; 100 %-ий ацетон, 96 %-ий розчин етилового спирту, петролейний ефір, етиловий ефір, гексан, бензин, MgCO3 або CaCO3, Na2SO4 зневоднений, кварцовий пісок; порцелянові ступки з товкачиками, скальпель, ножиці, пінцет, скляні палички, колба Бунзена, скляний фільтр № 3, мірні пробірки місткістю 10 мл, мірний циліндр місткістю 25 мл, конічні пробірки, центрифужні пробірки, піпетки об’ємом 2 і 5 мл, капіляри, хроматографічна камера з притертою кришкою, силуфольні пластинки, хроматографічний папір, фольга, ваги торсійні та центрифужні, центрифуга, канцелярські скріпки, лінійки, графітні олівці, насос Камовського або компресор, фен для підсушування хроматограм.

Хід роботи.

Отримання екстракту пігментів.

1. Наважку рослинного матеріалу (100.200 мг) подрібнити ножицями, перенести у порцелянову ступку, на кінчику скальпеля додати СаCO3, долити 4.5 мл спирту або ацетону та ретельно розтерти.

2. Отриманий екстракт перенести на скляний фільтр, вставлений у колбу Бунзена.

3. За допомогою насоса розчин відфільтрувати.

4. Рослинний матеріал повторно залити розчинником, розтерти та перенести на фільтр. Розчин відфільтрувати.

Примітка. Цю операцію повторюють доти, доки розчин,який стікає з фільтра, не буде абсолютно безбарвним.

5. Спиртовий екстракт пігментів перенести до мірної колби чи пробірки, колбу Бунзена промити декілька разів невеликими порціями суміші і довести сумішшю об’єм екстракту в мірній колбі до позначки.

Увага! Робота кількісна, не можна втрачати жодної краплі. Отриманий екстракт містить суміш зелених і жовтих пігментів.

Хроматографічне розділення пігментів.

Розділення виконують на хроматографічному папері або силуфолових пластинках розміром 15 х 15 см.

1. Пігменти нанести капіляром по всій ширині пластинки, відступаючи на 2 см від її нижнього краю та 1 см від бічних країв. Об’єм нанесеного екстракту – 0,5.0,8 мл (рис. а).

2. Хроматографічний папір або пластинку ретельно підсушити у струмені повітря, помістити у хроматографічну камеру, попередньо насичену сумішшю розчинників (наприклад, бензин, ацетон, петролейний ефір, гексан в об’ємних співвідношеннях 10:10:3:10; або бензин, петролейний ефір, ацетон в об’ємних співвідношеннях 8,5:3,5:3,5).

Примітка. Для кожного рослинного об’єкта суміш розчинників та їх об’ємне співвідношення добирається експериментально.

Розгонку проводять у затемнених чорним папером хроматографічних камерах зі щільно зачиненою кришкою (рис. б).

3. Після того, як рівень розчинника підніметься майже до верхнього краю пластинки, хроматограму вийняти та висушити під струменем повітря.

4. Проаналізувати хроматограму: визначити пігментні зони.

Рис.1. Схема нанесення стартової плями на хроматограму та хроматографічна камера:

а) хроматографічний папір або силуфольна пластинка з нанесенною смужкою пігментів;

б) хроматографічна камера з розчином і папером або пластинкою

Примітка. Порядок розташування окремих зон пігментів подано на рис. На хроматограмі стартова пляма може бути зеленою або рожевою за наявності хлорофілу й антоціанів, хлорофіл b – жовто-зеленого кольору, хлорофіл a – синьо-зелений, жовті ксантофіли і червоно-жовтий каротин (рухається разом із фронтом розчинника). Крім того, на хроматограмі часом виявляється бурий феофітин.

5. Для розділення лише каротиноїдів поставити другу хроматограму в іншу систему розчинників – суміш бензолу і петролейного ефіру (3:1).

Примітка. Пігменти розподіляються так: знизу стартова пляма, далі віолаксантин, лютеїн-епоксид, лютеїн, каротин. Між стартовою плямою і жовтими пігментами нерозділеними залишаються хлорофіли.

6. Для виявлення неоксантину поставити ще одну хроматограму в роздільну суміш етиловий спирт – петролейний ефір (1:20).

Примітка. Пігменти на хроматограмі розміщуються в такому порядку: зверху каротин, нижче хлорофіл а, суміш ксантофілів, хлорофіл b, неоксантин (рис. 2).

7. Хроматограми розшифрувати, в протоколі відмітити розташування та колір розподілених пігментів.

Визначення концентрації хлорофілів і каротиноїдів.

1. Забарвлені зони на хроматограмах, що відповідають каротину та ксантофілам (неоксантин, віолаксантин, антероксантин, лютеїн + зеаксантин), зняти скальпелем із 2.3 хроматограм. Зони однойменних пігментів об’єднати і помістити у пробірки з притертими пробками.

2. Проводять елюцію пігментів такими розчинниками: каротин – петролейним ефіром, ксантофіли – етанолом.

Примітка. Елюцію виконують під час струшуванні проб.

3. Елюат відфільтрувати через паперовий фільтр у мірні пробірки з притертою пробкою, фільтр кілька разів промити відповідним розчинником і довести об’єм до 3 мл.

3. Оптичну густину вимірюють на спектрофотометрі: каротин – за 452 нм, лютеїн – за 445, віолаксантин – за 442, неоксантин – за 438, хлорофіли а і b – у сірчаному ефірі за довжини хвилі відповідно 662 та 642 нм.

Примітка. Ці дані співставленні з питомими коефіцієнтами екстинкції (табл. 2).

Рис. 2. Розподіл пігментів на хроматограмі:

1 - каротин; 2 – феофітин; 3 – хлорофіл a; 4 – хлорофіл b; 5 – лютеїн + зеаксантин; 6 – віолаксантин; 7 – неоксантин; 8 – хроматографічна суміш.

Таблиця. Питомі коефіцієнти екстинкції для основних пігментів фотосинтезу

Пігмент	Максимум поглинання, нм	Розчинник	Питомий коефіцієнт екстинкції
β-Каротин		Хлороформ
Каротини		Петролейний ефір
α-Каротин		Хлороформ або гексан
Віолаксантин		Етанол
Лютеїн		-
Зеаксантин		-
Неоксантин		-
Антераксантин		-
Хлорофіл а		Сірчаний ефір	9,81
Хлорофіл b		-	17,6

4. Концентрацію пігментів (С, г/л) обчислити за формулою: де D – оптична густина за відповідної довжини хвилі, ум.од.; A – питомий коефіцієнт погашення, л/(г.см) (для каротину – 260, лютеїну – 258, віолаксантину – 225, неоксантину – 227), L – товщина шару розчину, см.

5. Вміст каротиноїдів в 1 г маси сирої речовини (А, мг/г) обчислити за формулою:

де С – концентрація пігментів, г/л; V – об’єм екстракту, мл;

К – відношення об’єму елюату до загального об’єму екстракту, нанесеного на хроматограмі; Н – наважка рослинного матеріалу, г.

Контрольні питання

1. Назвіть види хроматографічного аналізу. В чому полягає його суть?

2. Назвіть основні правила нанесення екстракту пігментів на хроматограму.

3. Якщо стартова пляма залишається зеленою, які пігменти містяться в ній?

4. Які пігменти забарвлюють стартову пляму в рожевий колір? Чому вони залишаються в ній, а не рухаються разом із розчинником?

6. Які пігментів беруть участь у фотосинтезі?

7. Які промені сонячного спектра поглинають хлорофіли а, b, каротини та ксантофіли?

8. Яка функція каротиноїдів у рослинах?

9. Чим відрізняються каротиноїди вищих і нижчих рослин?

10. Які розчинники застосовують для екстрагування пігментів?

11. За яких умов у спиртовому або ацетоновому розчині може міститися феофітин?