 |
Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | |
Робота № 40. Екстракція пластидних пігментів
|
|
Основні відомості. Пігменти з фотосинтезуючих тканин рослини екстрагують полярними розчинниками (етиловим спиртом, ацетоном), які руйнують їхній зв’язок із мембранами хлоропластів і тим самим забезпечують повне екстрагування пігментів. Під час розтиранні матеріалу з неполярними розчинниками, які не здатні денатурувати білки, в екстракт переходить незначна кількість пігментів.
Розтертий матеріал у спирті залишається зеленим і тоді, коли в ньому спостерігається висока активність ферменту хлорофілази, яка відщеплює спирт фітол від хлорофілу. Тоді утворюється хлорофілід зеленого кольору з такими самими спектральними характеристиками, що і хлорофіли, але з гідрофільними властивостями. Тому хлорофілід не розчиняється в полярних розчинниках, а осад на фільтрі після екстракції фотосинтетичних пігментів залишається зеленим.
Для отримання витяжки пігментів можна використовувати як сирий, так і сухий матеріал. В останньому випадку висушені листки попередньо обробляють гарячою водою, щоб спростити процедуру вилучення пігментів з них.
Мета роботи. Отримати екстракт пластидних пігментів із рослин різних систематичних груп, проаналізувати повноту екстракції пігментів використовуючи воду, полярні та неполярні розчинники.
Матеріали, реактиви, обладнання. Листки пеларгонії, персика, проростки гороху, кукурудзи, пшениці; ацетон, етиловий спирт, петролейний ефір або гексан, карбонат кальцію; порцелянові ступки, скляні пластинки для подрібнення матеріалу, скляні палички, фільтри Шотта N 3 або N 4, колби Бунзена, центрифужні та мірні пробірки, ножиці, свердла, вакуумні насоси, ваги з різноважками.
Хід роботи.
1. Листки різних рослин подрібнити ножицями або скальпелем.
2. Подрібнену наважку (0,2.0,5 г) розтерти у ступці, додаючи на кінчику скальпеля CaCO3 для нейтралізації кислот клітинного соку.
3. Зволожити матеріал незначною кількістю розчинника, розтерти до гомогенної маси і кількісно перенести на фільтр Шотта, змиваючи багаторазово ступку невеликими порціями ацетону (варіант перший), спирту (варіант другий), петролейного ефіру (варіант третій) і водою (варіант четвертий).
4. Фільтр Шотта вставити в пробірку, що міститься в колбі Бунзена, яку з’єднати із насосом.
5. Розчини відфільтрувати, змиваючи стінки фільтра невеликими порціями розчинника доти, поки відфільтрована рідина на стане безбарвною.
6. Об’єм розчину довести відповідними розчинниками до 10 мл.
7. Вміст у пробірці збовтати. Порівняти забарвлення розчинів візуально.
8. Визначити екстинцію отриманих екстрактів на фотоелектроколориметрі за довжини хвилі 660 нм.
Примітка. У контрольну кювету наливають розчинник, а в іншу – досліджуваний розчин.
9. Результати спостережень записати до таблиці.
Таблиця. Ефективність використання різних органічних розчинників для екстракції ластидних пігментів
| Рослина | Варіант досліду, використаний екстрагент | Оптична густина розчину, ум. од. |
| Ацетон | ||
| Спирт | ||
| Петролейний ефір | ||
| Вода |
10. За величиною екстинції розчинів зробити висновок про розчинність пластидних пігментів у різних розчинниках. Пояснити одержані дані, враховуючи стан пігментів у хлоропластах і їхню хімічну природу.
Контрольні питання
1. Чому вода не екстрагує пігменти хлоропластів?
2. Чим можна пояснити наявність каламуті в водно-ацетонових розчинах пластидних пігментів?
3. Чим можна пояснити той факт, що після промивання 80 %-им ацетоном або 96 %-им етиловим спиртом осад із листків персика і борщівника залишається зеленим?
Робота № 41. Методи виділення пластидних пігментів з листків.
Основні відомості. Фотосинтез – процес утворення органічних речовин із диоксиду вуглецю і води з використанням енергії світла:
пігменти
6 CO2+ 6 H2O ® C6H12O6 + 6 O2.
світло
Щоб детально вивчити хімічні і фізичні властивості пігментів, їх вилучають із зелених тканин рослин і відокремлюють один від одного. Пігменти зелених листків не розчинні у воді, але добре розчиняються в ліпоїдних розчинниках. Їх можна екстрагувати із свіжого і фіксованого матеріалу. Вибираючи розчинники, слід враховувати розчинність самих пігментів. Залежно від хімічного складу, розрізняють полярні (спирти, ацетон) і неполярні (бензин, петролейний ефір, гексан та ін.) розчинники.
Зелені і жовті є ліпофільними сполуками, а тому добре розчиняються у всіх розчинниках: спирті, ацетоні, бензині, ефірі, петролейному ефірі тощо. Найкраще зелені пігменти екстрагуються з листків полярними розчинниками або сумішшю полярних і неполярних розчинників. У навчальних лабораторіях найчастіше пігменти з листків вилучають спиртом або ацетоном. Пігменти доцільно вилучати з листків різних екологічних груп рослин, різних ярусів рослини тощо.
Мета роботи. Навчитися екстрагувати суміш пігментів з зелених листків.
Матеріали, реактиви, обладнання. Листки кімнатних рослин, етиловий спирт, чистий кварцовий пісок, фарфорові ступки, ножиці, лійки, фільтрувальний папір, штатив з пробірками, вазелін.
Хід роботи.
Для вилучення пігментів листка можна використати такі способи:
Свіже листя нарізають ножицями (забирають середню жилку і черешок) і кладуть у ступку. До подрібненої маси додають трохи чистого кварцового піску і 5 мл 95%-го етилового спирту. Суміш старанно розтирають до утворення однорідної маси, поступово доливаючи етиловий спирт (5 мл). Розтирають, доки етиловий спирт не забарвиться в інтенсивний зелений колір. Носик ступки з зовнішнього боку змазують вазеліном і Для екстракції хлорофілу з сухого матеріалу беруть сухі листки, розти-рають їх у фарфоровій ступці в порошок, видаливши всі жилки. До порошку до-ливають міцного етилового спирту, знову розтирають. Розтерту масу відфільтро-вують через складчастий фільтр у суху чисту пробірку.
Свіже або сухе листя опустити у киплячу воду на 1-2 хвилини. Після того, як листочки будуть убиті, переносять їх у пробірку з етиловим спиртом. Пробірку ставлять на водяну баню і тримають на нагрітій водяній бані доки спирт не забарвиться в зелений колір, а шматочки листку не знебарвляться. Екстракт пе-реливають у сухий чистий посуд.
Свіжонарізане листя кладуть у банку зі спиртом, щільно закривають пробкою і дають настоятися (12-24 години), одержаний екстракт профільтрувати в чисту посудину і закрити.
Контрольні питання
1. Які пігменти містяться в хлоропластах зелених рослин?
2. Як вилучити пігменти з листка?
3. В якому стані знаходяться пігменти в розчині і в листку?
4. Чому у багатьох рослин верхній бік листків більш зелений, ніж нижній?
5. На які групи поділяють пігменти зеленого листка?
Робота № 42. Розподіл пігментів за Краусом. Омилення хлорофілу лугом.
Мета роботи. Дослідити, що 96% етиловий спирт екстрагує з зелених фотосинтезуючих тканин рослин зелені та жовті пігменти, які характеризуються різними фізичними і хімічними властивостями, в тому числі розчинністю у водних полярних і безводних неполярних розчинниках. Крім того, метою досліду є оз-найомлення з реакцією одержання продуктів омилення хлорофілу.
Матеріали, реактиви, обладнання. Спиртова витяжка пігментів зеленого листка, пробірки, бензин, 20%-й розчин гідроксиду калію, вода.
Основні відомості. Метод розподілу зелених і жовтих пігментів за Г.Краусом ґрунтується на різній розчинності їх в етиловому спирті і бензині. Ці розчинники при зливанні не змішуються і утворюють дві фази: верхню (бензинову) і нижню (спиртову). Завдяки цьому відбувається розподіл компонентів суміші.
При обробці лугом ефірні зв’язки омилюються, в результаті чого від його молекули відщеплюється спирти фітол і метанол. Другий продукт, який утворюється під час реакції, лужна сіль хлорофілінової кислоти, зберігає зелене забарвлення і оптичні властивості хлорофілу.
Хід роботи. В пробірку наливають 3 мл концентрованого екстракту пі-гментів з листків різних рослин, доливають в неї 6 мл бензину і 2-3 краплини води. Пробірку закривають пробкою і добре збовтують її вміст. Спостерігають розшарування розчину на зелений (верхній) і жовтий (нижній) шари. У верхньому бензиновому шарі розчинені хлорофіли і каротин (сильно гідрофобні речовини), в нижньому водно-спиртовому – ксантофіл.
Щоб виявити каротин, у пробірку добавляють 15 краплин 20%-го розчину KOH і сильно збовтують її вміст. Спостерігають перерозподіл забарвлених шарів внаслідок утворення солі хлорофілінової кислоти (реакції омилення хлорофілу). Жовте забарвлення верхнього шару в пробірці зумовлене каротином. Солі хлорофілінової кислоти, як і хлорофіл, зелені, але характеризуються гідрофільністю і тому перерозподіляються в нижній водно-спиртовий шар.
Контрольні запитання.
1. Чим зумовлена гідрофобність молекули хлорофілу?
2. Які зміни в структурі молекули хлорофілу відбуваються при її омиленні?
3. Чим хлорофілінова кислота відрізняється від її солей?
4. Чим каротини відрізняються від ксантофілів?
Робота № 43. Розподіл пігментів адсорбційним хроматографічним методом.
Основні відомості. Вперше швидкий метод розподілу окремих компонентів із суміші фотосинтезуючих пігментів запропонував у 1904 році М.С.Цвєт шляхом адсорбційної хроматографії на колонках. Адсорбційна хроматографія ґрунтується на властивості речовин, які зазнають розподілу, вибірково адсорбуватися з розчинника на твердому порошкоподібному адсорбенті. Вона в свою чергу поділяється на молекулярну та іонообмінну. Для розподілу досліджувану суміш пропускають крізь колонку, наповнену адсорбентом (сахарозою, карбонатом кальцію, клітковиною крохмалю, силікагелем та ін.). Компоненти суміші адсорбуються на матеріалі колонки під дією молекулярних сил. Для кожного компоненту суміші ці сили неоднакові, тому, коли суміш пропускають крізь шар сорбенту, різні її компоненти розташовуються в колонці сорбенту у вигляді окремих зон з різним забарвленням. Отже, всі компоненти досліджуваної суміші залежно від відносної адсорбційної спорідненості до сорбенту утворюватимуть певний адсорбційний ряд.
Мета роботи. Ознайомитися з адсорбційним хроматографічним методом розподілу компонентів із суміші пігментів.
Матеріали, реактиви, обладнання. Спиртовий екстракт пігментів з ли-стків різних рослин, фільтрувальний папір, хімічні склянки, чашки Петрі, ножиці.
Хід роботи. Цей метод розділення пігментів заснований на різних ступенях поглинання пігментів адсорбуючими речовинами. Такою речовиною може служити фільтрувальний папір. В хімічну склянку приблизно на висоту 10 мм наливають спиртовий екстракт суміші пігментів. В нього занурюють смужку фільтрувального паперу (10 мм завширшки та завдовжки 100 мм). Зелені пігменти адсорбуються сильніше, тому на папері з’являються спочатку зелена смужка хлорофілу, потім вище за них – жовта (каротину і ксантофілу), і нарешті – найвища смуга – безколірна від чистого спирту.
На кружку фільтрувального паперу роблять поряд два надрізи до центру. Смужка відгинається і занурюється в спиртовий розчин пігментів, налитий у чашку Петрі. Адсорбція пігментів фільтрувальним папером дає кольорові концентричні кола – хроматограму пігментів листка.
Контрольні питання.
1.На чому грунтується адсорбційний метод розподілу пігментів?
2.Хто є його автором?
3.В якій послідовності проходить розподіл пігментів на фільтрувальному папері?
Робота № 44. Утворення феофітину і відновлення металоорганічного зв’язку.
Основні відомості. Хлорофіл характеризується лабільністю і легко взаємодіє з іншими речовинами. За хімічною природою хлорофіл – складний ефір дикарбонової кислоти хлорофіліна і двох спиртів – метанолу CH3OH і фітолу С20Н39ОН. Хлорофілін в свою чергу складається з порфіринового ядра, яке має чотири, сполучені між собою метиновими (=CH-) містками, пірольних кільця. В центрі порфіринового ядра знаходиться атом магнію, з’єднаний з атомами азоту пірольних кілець. Під дією кислот з молекули хлорофілу витісняється магній і утворюється бурого кольору феофітин. У природних умовах побуріння раніше сроку зелених рослин свідчить про утворення в клітинах феофітину під впливом тих або інших стресових умов (висока температура, проморожування тканин). Разом з тим ця сполука утворюється і в процесі фотосинтезу.
Мета роботи. Одержати феофітин з витяжки хлорофілу за допомогою соляної кислоти, а також пересвідчитися, що зміна кольору екстракту залежить від наявності в молекулі металу.
Матеріали, реактиви, обладнання. Спиртовий екстракт пігментів, 20%-ний розчин соляної кислоти в крапельниці, ацетат цинку, ацетат міді, штатив з пробірками, пробіркотримачі, спиртівки.
Хід роботи. В три пробірки наливають по 3 мл спиртового екстракту пі-гментів. В дві з них додають 2-3 краплі 20%-го розчину соляної кислоти і злегка збовтують. Під дією кислоти зелене забарвлення зникає і витяжка набуває оливково-бурого кольору – утворюється сполука, яка дістала назву феофітин.
Далі одну з пробірок з феофітином залишають як контроль, а в другу вносять трохи (на кінці скальпеля) ацетату цинку або ацетату міді і нагрівають на спиртівці до кипіння. При цьому оливково-буре забарвлення зникає і знову з’являється зелене в результаті відновлення металоорганічного зв’язку і утворення металозаміщеного хлорофілу.
В протоколах робіт зарисовують пробірки з феофітином і цинкпохідним (або мідьпохідним) хлорофілом та роблять висновки про те, що зелене забарвлення хлорофілу зумовлене наявністю в його молекулі металоорганічного зв’язку.
Контрольні питання.
1.Чим зумовлене зелене забарвлення хлорофілу?
2.Що таке феофітин?
3.Як відновити зелене забарвлення витяжки після дії на неї соляної кислоти?
Робота № 45. Спостереження за флуоресценцією хлорофілу.
Основні відомості. Крім вибіркового поглинання світлової енергії, хлорофіл характеризується здатністю до флуоресценції. Випромінювання світлової енергії при переході фотозбудженої молекули хлорофілу з синглетного стану дістало назву флуоресценції. Вірогідність випромінювання поглинутої енергії у вигляді квантів флуоресценції залежить від хімічної структури речовини, фізичного стану, можливості міграції енергії в системі тощо. Спектри флуоресценції, як і спектри поглинання, є важливими фізичними параметрами, що характеризують хімічну природу і стан зелених пігментів. Для всіх пігментів, які належать до класу порфіринів, характерна інтенсивна флуоресценція в червоній ділянці спектра. Здатність хлорофілів інтенсивно флуоресціювати свідчить про їх високу фотохімічну активність.
Мета роботи. Спостерігаючи за флуоресценцією, переконатися у фотохі-мічній активності хлорофілу; констатувати інтенсивну флуоресценцію розчинів пігментів і видиму відсутність її у живих листках.
Матеріали, реактиви, обладнання. Мікроскопи, предметні скельця, еле-ктрична лампа, пробірки, елодея, спиртова витяжка пігментів зеленого листка.
Хід роботи. У пробірку наливають спиртову витяжку хлорофілу і розгля-дають її проти світла на рівні очей. Витяжка хлорофілу має смарагдово-зелений колір. Далі цю саму пробірку вміщують на темний папір біля електричної лампи і розглядають її з того боку, звідки падає світло. У відбитому світлі витяжка хлорофілу матиме вишнево-червоний колір. Флуоресценцію можна спостерігати і в живому листку. З цією метою беруть листок елодеї, вміщують на предметне скло і розглядають під мікроскопом (при цьому препарат освітлюють синьо-фіолетовими променями). Під дією синьо-фіолетових променів хлоропласти в полі зору мікроскопа починають світитися червоним світлом.
Контрольні запитання.
1.Що таке флуоресценція?
2.Про що свідчить наявність флуоресценції у хлорофілів?
3.Чому флуоресценція хлорофілу в живих листках не помітна?
Робота № 46. Утворення первинного крохмалю у фотосинтезуючому листку.
Основні відомості. В процесі фотосинтезу утворюються різні органічні сполуки, які рослини використовують для процесів життєдіяльності. Близько 30-50% їх відкладаються в фотосинтезуючих органах у вигляді крохмалю. Це наочно може бути проілюстровано так званою пробою Сакса. Крохмаль, який синтезується в хлоропластах у процесі фотосинтезу, називають первинним, на відміну від того, що відкладається в запасаючих органах.
Мета роботи. Дослідити, що в процесі фотосинтезу синтезуються вуглеводи, які відкладаються в листках у вигляді крохмальних зерен.
Матеріали, реактиви, обладнання. Листки пеларгонії, примули або інших кімнатних рослин з ніжними листками, які перед дослідом протягом двох діб витримують в темряві; спиртівки, пінцети, препарувальні голки, скляні палички, темний світлонепроникний папір, канцелярські скріпки або булавки, етиловий спирт, 1%-ний розчин йоду в йодиді калію, порцелянові чашки, електроплитка.
Хід роботи. На листки рослин, витриманих у темряві протягом двох діб, наколюють різні фігури, вирізані з темного світлонепроникного паперу. Рослини виставляють на яскраве сонце або освітлюють потужними лампами протягом 1-2 год. По закінченні експозиції фігурки знімають, листки зрізують і кип’ятять у воді 1-2хв. Потім зливають воду і наливають спирт у пробірки та настоюють на водяній бані до повного знебарвлення від пігментів. Знебарвлені листки переносять в чашки Петрі з водою для охолодження, потім воду зливають і розправлене на чашці листя обробляють розчином йоду в KI. Спостерігають, що на місцях, де були фігури, знаходяться світлі місця, а навколо них – темний фон внаслідок синтезованого в процесі фотосинтезу крохмалю. Це пояснюється тим, що крохмаль з йодом дає синє забарвлення.
Контрольні питання.
1.Які процеси відбуваються в листках, коли рослини перед дослідом витримують в темряві?
2.Чому підчас фотосинтезу в листках відкладається первинний крохмаль? Яке це має значення для процесу фотосинтезу?
3.Назвіть первинні продукти фотосинтезу. Опишіть, з яких сполук синтезується крохмаль і які ферменти беруть участь.
4.Як називають цикл, в якому відбувається відновлення СО2 до моносахаридів? З чого синтезується глюкоза, потрібна для синтезу крохмалю?
Дата публикования: 2015-09-18; Прочитано: 4200 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!
