Г. Реакция на молочную кислоту

Принцип метода. При добавлении молочной кислоты к свежеприготовленному раствору фенолята железа аметистового цвета образуется лактат железа желто-зеленого цвета.

Ход определения. К 15 мл раствора фенола добавить несколько капель хлорида

железа (III). Перемешать. Получившийся реактив аметистового цвета разбавить водой до слабой окраски. В 3 пробирки налить по 15 капель полученного реактива. В первую пробирку добавить по каплям раствор молочной кислоты. Во вторую - 1 мл свежевзятой слюны, а в третью – слюну с добавлением раствора молочной кислоты.

Результаты:

Выводы:

Практическое значение работы. При некоторых заболеваниях полости рта в смешанной слюне может содержаться в повышенном количестве молочная кислота, что является фактором риска развития кариеса. Лактат является продуктом жизнедеятельности анаэробных микроорганизмов зубного налета.

Работа 4. Количественное определение активности амилазы слюны по Вольгемуту

Амилаза (α-амилаза, КФ 3.2.1.1, диастаза) – фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы. Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой слюнные и поджелудочная железы. Амилаза содержится также и в крови, куда попадает, главным образом, из поджелудочной железы. α-Амилаза помимо выполнения пищеварительной функции может связываться с плазматической мембраной ряда бактерий и вовлекаться в антисептические процессы.

Принцип метода. Метод основан на том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и то же количество раствора крахмала и находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала. Затем производят перерасчет активности фермента на 1 мл слюны. Амилазная активность слюны выражается количеством 0,1%-ного раствора крахмала в миллилитрах, которое может расщепляться 1 мл слюны при температуре 37˚С в течение 30 минут.

В норме амилазная активность слюны составляет 320-640 ед.

Ход работы. В 10 пронумерованных пробирок наливают из бюретки по 1 мл воды. В 1-ю пробирку добавляют 1мл слюны, разведенной в 10 раз. Содержимое пробирки перемешивают и 1мл раствора переносят из первой пробирки во вторую, перемешивают и из второй – таким же образом в 3-ю и т.д. до 10-й пробирки. Из десятой пробирки 1 мл смеси выливают. Таким образом, получается ряд разведенной слюны, в котором в каждой последующей пробирке содержится фермента вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все пробирки добавляют по 1мл воды и по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала, перемешивают и помещают пробирки в водяную баню на 30 минут при температуре 37˚С.

Через 30 минут пробирки вынимают, охлаждают, добавляют по 1-2 капли 1%-ного раствора йода и перемешивают. Жидкость в пробирках может окрашиваться в желтый, красный и фиолетовый цвет. Раствор желтого цвета свидетельствует о полном расщеплении крахмала, фиолетовый – что крахмал в растворе еще сохранился.

Оформление работы. Работу необходимо оформить в виде таблицы.

№№ пробирок
Разведение слюны
Количество мл.0,1%-ного раствора крахмала
Окрашивание йодом
Амилазная активность слюны

Расчет: Для расчета берется количество слюны в последней пробирке желтой окраской. Если это 4-я пробирка, то разведение в ней слюны в 160 раз. Составляется пропорция:

1/160 мл слюны расщепляет 2 мл 0, 1%-ного раствора крахмала

1 мл слюны расщепляет Х мл 0,1%-ного раствора крахмала

Х=2х160=320 мл 0,1%-ного раствора крахмала.

Следовательно, амилазная активность слюны равна 320 условным единицам

Результат:

Вывод:

Практическое значение работы. Изучение химической структуры α-амилазы слюны показало ее схожесть со структурой панкреатической α-амилазы. Известно также, что при панкреатитах активность амилазы слюны иногда повышается в 20-30 раз. Очевидно, нарушение внешнесекреторной функции поджелудочной железы сопровождается гиперплазией околоушных слюнных желез, которые компенсаторно увеличивают продукцию амилазы слюны, и определение активности амилазы в слюне больных панкреатитом может быть объективным тестом, характеризующим интенсивность патологического процесса. Выявление амилазы, благодаря ее высокой активности в слюне, позволяет идентифицировать слюну в судебно-медицинской практике на одежде и предметах по гидролизу крахмала.