Методы выделения и очистки белков

Последовательность операций по выделению белков обычно сводится к измельчению биологического материала, экстрагированию белков (т.е. переводу их в растворенное состояние) и, наконец, выделе­нию исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистке и получе­нию индивидуального белка. Все операции проводят при температуре, близкой к 0°С и не применяют сильных кислот и оснований, чтобы избе­жатьденатурации.

Исходный биологический материал измельчают при помощи но­жевых или пестиковых гомогенизаторов, часто используют валковые или шаровыемельницы. Кроме того, применяется метод попеременного за­мораживания и оттаивания ткани, в основе разрушающего действия ко­тороголежат разрывы клеточной оболочки, вызванные кристалликами льда.Для разрушения тканей используют также ультразвук, пресс-методы и метод "азотной бомбы", который заключается в насыщении клетоказотом под высоким давлением, а затем резким сбрасыванием давления - выделяющийся газообразный азот как бы "взрывает" клетки.

Измельченную ткань заливают экстрагентом, в качестве, которо­гоиспользуют 8-10% растворы солей, буферные смеси, органические растворители, а также неионные детергенты - вещества, нарушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами, между белко­вымимолекулами. Однако ими пользуются осторожно, чтобы не нарушить третичную (четвертичную) структуру белков. Из органических соединенийиспользуют водные растворы глицерина и слабые растворы сахарозы. Таккак растворению и стабилизации белков способствуют кислые и слабощелочные среды, то в качестве буферных смесей исполь­зуютфосфатные, цитратные, боратные буферные смеси. Нерастворимые частиткани осаждают центрифугированием. В надосадочной жидкости содержатся растворимые белки.

Главнаятрудность выделения индивидуального белка в его от­делении отостальных белков, так как все белки обладают сходными свойствами и ихразделение основано на небольших различиях в свойст­вах разных белков.

Рассмотрим ряд методов выделения белков.

1. Избирательная денатурация. Многие белки денатурируются и выпадают в осадок при нагревании раствора до 50-70 °С или при подкислении до рН ≈ 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то часть посторонних белков можно удалить из раствора таким способом.

2. Высаливание представляет собой процесс осаждения белков из раствора при добавлении различных солей. Чаще всего используют зависимость растворимости белков от концентрации сульфата аммония. Если в раствор добавить небольшое количество (NH₄)₂SO₄, (например, 10г на 100мл раствора), то наименее растворимые белки выпадут в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, а к надосадочной жидкости до­бавляют еще 10 г (NH₄)₂S0₄ и получают второй осадок. Продолжая эту процедуру, получают ряд фракций: в одной из них содержание искомого белка больше, чем в других.

3. Методы ионно-обменной хроматографии и электрофореза основаны на различиях в количестве и природе ионогенных групп амино­кислотных радикалов. Для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров.

Электрофорез применяют в различных вариантах. Наиболее простой из них - электро­форез на бумаге. Полоску фильтровальной бумаги пропитывают буфер­ным раствором и включают ее в электрическую цепь с постоянным то­ком. Процедуру проводят в герметически закрытой камере. Белки из электрофореграмме обнаруживают, обрабатывая полоску красителем, связывающимся с белками и образующим цветные соединения. После окончательного разделения белков на фракции, в зависимости от заряда белковой молекулы, отдельные белки вымывают (предварительно разре­зав полоску на части) подходящим растворителем и осаждают. Для полу­чения больших количеств очищенного белка вместо полоски бумаги в этом методе используют толстый блок какого-либо инертного материала - крахмала, целлюлозного порошка или полимеры, образующие гели - агар, полиакриламид.

4. Методы гель-фильтрации и ультрацентрифугирования основаны на различиях белков по молекулярной массе.

Молекулярная масса белков достигает десятки и сотни тысяч атомных единиц массы (а.е.м., или Да). Обычные методы определения молекулярной массы - криоскопия и эбулиоскопия - для белков неприме­нимы. Для определения молекулярных масс белков разработаны спе­цифические методы. Наиболее распространенный из них - метод ультра­центрифугирования, разработанный шведским ученым Сведбергом. Он основан на измерении скорости седиментации веществ. Во вращающемся роторе ультрацентрифуги центробежное ускорение достигает 100000 - 500000 g (g - ускорение свободного падения). На поверхность буферного раствора, налитого в кювету ультрацентрифуги, наносят тонкий слой раствора белка и кювету помещают в ротор. При вращении ротора более плотные, чем растворитель, молекулы белка перемещаются в направле­нии от оси вращения. Положение белковой зоны регистрируют специаль­ной оптической системой по показателю преломления, который больше в зоне белка, чем в буферном растворе. На основании результатов центрифигурирования вычисляют коэффициент седиментации

где

х - расстояние от оси вращения до белковой зоны, см;

t - время седиментации, с;

dx/dt –скорость седиментации, см/с;

ω- угловая скорость вращения ротора, рад/с.

За единицу коэффициента седиментации условно принята величина 10^-13 с, называемая сведбергом и обозначаемая "S".

Молекулярная масса белка пропорциональна его коэффициенту седиментации, коэффициенту диффузии и плотности:

Где

R - универсальная газовая постоянная (8.314 Дж/град моль);

Т - абсолютная температура опыта;

S - коэффициент седиментации, с;

О - коэффициент диффузии, см²/с;

V - удельный парциональный объем молекулы белка, т.е. вели­чина, обратная плотности молекулы, см³/г;

р - плотность растворителя при данной температуре, г/см³.

Более просто молекулярную массу белка можно определить ме­тодом гель-фильтрации, или молекулярного просеивания. Метод основан на применении специальных полимерных веществ (например, сефадекс), набухшие зерна которых име­ют поры определенного размера. Небольшие молекулы легко проходят в эти поры, а диффузия крупных молекул затруднена. Это явление и лежит в основе разделения веществ методом гель-фильтрации. Принципиаль­ная схема метода изображена на рисунке приведенном ниже, белковый раствор вместе с буфе­ром перемещаются вдоль колонки между гранулами сефадекса. Белки проходят медленнее, чем буферный раствор, причем тем медленнее, чем меньше молекулярная масса белка, так как их молекулы легче диффун­дируют внутрь гранул сефадекса.

В результате в колонке образуются отдельные зоны белков: чем ниже расположена зона, тем больше молекулярная масса белка. Белко­вые фракции, различающиеся молекулярной массой, собирают в отдель­ные пробирки и идентифицируют хроматографически. Между объемом вымывания (объем буфферного раствора, затраченный на вымывание из ко­лонки данной фракции - V, мл) и логарифмом молекулярной массы (IgM) - линейная зависимость (см. рис.9,б). Предварительно колонку калибру­ют, пропуская через нее растворы стадартных белков с известной молекулярной мас­сой.

Очистка белков

Белки, всегда содер­жат некоторое количество низкомолекулярных примесей, особенно ионов солей. Для полного освобождения от этих примесей белки подвергают дальнейшей очистке путем диализа, электродиализа, кристаллизации и перекристаллизации.

Метод диализа состоит в длительном (сутки и больше) пропус­кании воды через сосуд, в который погружен диализационный мешочек с раствором белка. Его делают из материалов, хорошо проницаемых для маленьких молекул и ионов, но не пропускающих большие молекулы белка. К таким материалам относят целлофан, коллодиевую пленку и др. Таким образом, происходит вымывание низкомо­лекулярных примесей из раствора белка через диализационный матери­ал, внутри остается белок. Затем диализ продолжают еще 1-3 суток дис­тиллированной водой. Но даже после диализа на поверхности белковых молекул могут оставаться частично ионы. Потому далее полученный рас­твор белка подвергают электродиализу: против мембран диализационной камеры (мешочка) помещают электроды, на которые подают напряже­ние, в результате чего в омывающую мембраны воду уходят остатки ио­нов.