Разложение целлюлозы

Эффективный гидролиз целлюлозы требует взаимодействия нескольких гидролаз, и поэтому организмы секретируют разные эндоглюканазы и экзоглюканазы (целлобиогидролазы). Целлюлазная система целлюлолитических организмов всегда ассоциирована с другими гидролазами полисахаридов, особенно ксиланазами.

Целлюлазы содержат два домена: каталитический и связывающий. Такой принцип организации свойственен и другим гидролазам полисахаридов. Связывающие домены могут входить в S-слой бактерий. Целлюлазы и ксиланазы секвенированы для многих организмов, и у бактерий их строение широко варьирует. Для каждого семейства ферментов классификация, основанная на их последовательности, находится в противоречии с принятой филогенией бактерий, снова подтверждая, что эти гены распространялись путем интенсивного латерального переноса. Это особенно свойственно семействам ферментов, содержащих гены и из грамотрицательных и из грамположительных организмов: например, сходны целлюлазы у Erwinia и Cellulomonas. Вместе с тем активный центр каталитического домена гидролаз отличается стереоспецифичностью и консервативностью. Он включает в разных типах реакции либо глутаминовую, либо аспарагиновую кислоты для нуклеофильной атаки через образование промежуточного оксокарбониевого продукта.

Целлюлозосвязывающий домен обеспечивает связывание с целлюлозой. У грибов он содержит 33-36 аминокислот и очень консервативен. У бактерий этот домен варьирует и обнаруживается в целлюлазах, ксиланазах, хитиназах; он содержит около сотни аминокислот, у бацилл и клостридий 130-170 аминокислот. От этого домена зависит специфичность энзима по отношению к форме полисахарида. Другим компонентом целлюлаз служит участок, обеспечивающий связь с клеткой целлюлозолитического организма, обычно богатый пролином.

Целлюлозолитическая система микроорганизмов обычно включает набор гидролаз полисахаридов. Это наблюдается для разложения не только природного материала, но и очищенной целлюлозы. В результате организмы содержат гены нескольких целлюлаз. Например, у штамма Clostridium thermocellum их было обнаружено 15. Некоторые целлюлозолитические организмы имеют набор ферментов, достаточный для разложения нативной растительной целлюлозы. Такие наборы есть у грибов бурой древесной гнили, у клостридиев, организмов рубца. У фитопатогенных и симбиотических организмов имеется специфический неполный набор целлюлаз для внедрения через растительную стенку в корни. Неполный набор целлюлаз возможен и для организмов, являющихся членами целлюлозолитического консорциума; такие организмы не способны расти в чистой культуре на целлюлозе, но активно размножаются в сообществе.

Целлюлозолитические энзимные системы разделяются на “не-комплексирующие” (или “неагрегирующие”, растворимые) и комплексирующие системы. Первые свойственны преимущественно аэробным грибам и бактериям. Они выделяются в среду как экзогидролазы в виде нескольких растворимых целлюлаз и деполимераз полисахаридов. Комплексирующие системы типичны преимущественно для анаэробов.

Синергическое действие растворимых целлюлаз приводит к тому, что смесь ферментов имеет более высокую активность, чем сумма их активностей. Предложено следующее объяснение синергическому усилению действия. Эндоглюканазы разрывают целлюлозную цепочку в местах нарушения кристаллической структуры. В этих разрывах появляются точки приложения для экзоглюканаз (или целлобиогидролаз). Гидролиз концов кристаллических участков обнажает новые места нарушения кристаллической структуры. Гидролиз целлобиозы Р-глюкозидазой приводит к появлению глюкозы как конечного продукта, ингибирующего гидролазы. В этой схеме независимо действующие ферменты без взаимодействия белок-белок усиливают кооперативное действие.

Комплексирующие системы целлюлаз представляют собой полиферментные комплексы, получившие название целлюлосомы. Они характерны для клостридиев и в качестве модели подробно изучены у Clostridium thermocellum. Целлюлосомы образуют протуберанцы на поверхности клетки и содействуют адсорбции клетки на нерастворимой целлюлозе. Индивидуальные целлюлосомы устойчивы в воде и обладают высокой целлюлолитической активностью вне зависимости от клетки. Они содержат 14-50 полипептидов, большинство из которых обладает а-1,4-глюканазной или а-1,4-ксиланазной активностью. Клостридии содержат многочисленные гены, глюканаз, представляющие ферменты различных семейств. Целлюлосомы под электронным микроскопом выглядят как несколько (более четырех) цепочек из 5-8 глобул. Предполагается, что это индивидуальные эндоглюканазы на общем основании. Такая, система способна координированно атаковать целлюлозу с образованием в качестве продукта декстрина. Белок основания связывается с целлюлозой и заякоривает фермент на ней. Он предположительно обеспечивает перемещение ферментного комплекса по гидролизуемому субстрату. Белки целлюлосомы и соответствующие гены идентифицированы. Для высокой активности целлюлосомы критическим оказывается координированное действие ферментов.

Аналогичные целлюлосомам системы ферментов установлены у Ruminococcus, Bacteroides cellulosolvens, Bacteroides (Fibrobacter) succinogenes, Acetivibrio cellulolyticus - анаэробных организмов, которые плотно прикрепляются к гидролизуемой целлюлозе. Прикрепление дает определенное преимущество в смешанных культурах. На поверхности клеток были обнаружены аналогичные целлюлосомам, протуберанцы. Часть эндоглюканаз обнаруживается в везикулах капсулы руминококков. Однако генетического подтверждения сходства с целлюлосомами клостридиев пока нет, хотя они реагируют с антителами для целлюлосом.

У разных организмов ферменты целлюлозолитической системы синтезируются конституитивно или же индуцируются. Индуктором синтеза целлюлаз и ксиланаз может служить целлобиоза, продукт экзоглюканаз, и целлодекстрины как продукты эндоглюканаз. Индукторами могут служить и иные олигосахариды. Особенно эффективным индуктором считается сефароза. С другой стороны, эти же соединения могут ингибировать синтез. Поэтому существенна их концентрация в среде и транспорт в клетку.

Из рассмотрения действия целлюлозолитических организмов и ферментов можно вывести необходимость, по меньшей мере, трех уровней кооперативного действия. Первый уровень состоит в действии различных ферментов на субстрат. При этом ферменты либо могут действовать индивидуально и при этом иметь синергический эффект, либо быть организованы в структуру, обладающую кооперативным действием, как в целлюлосоме. На уровне организма возможен синтез полного набора ферментов одним организмом, способным расти на целлюлозе в чистой культуре, и осуществлять ее полный гидролиз. При неполном наборе ферментов используется только часть полимерного материала, хотя рост еще возможен; либо рост отсутствует, несмотря на наличие целлюлаз. Наконец, на уровне кооперативно действующего сообщества разные организмы, синтезирующие разные гидролазы, оказывают совместное действие и развиваются в виде сообщества, быстро гидролизуя субстрат, хотя поодиночке они на целлюлозе не растут или же рост их ограничен. Синтрофия обусловлена не анаболической зависимостью от факторов роста в сообществе, а кооперативным воздействием на сложный субстрат.

Следующий шаг состоит в разложении сложного взвешенного вещества, где присутствуют и разные полисахариды, и белки, и липиды, как это имеет место при разложении мортмассы. Здесь возможно не только синергическое действие, но и реакции торможения, например, за счет протеолиза незащищенных экзоферментов. Физическая организация на микроуровне приобретает первостепенное значение, включая защиту ферментных комплексов от угрозы извне.

Вся обширная группировка наземных целлюлозолитических микроорганизмов и их сателлитов сформировалась после развития на Земле растительного покрова. Широкое распространение этой трофической группировки могло иметь место в конце силура 0,35 млрд. лет назад, хотя водные целлюлозолитические бактерии могли развиваться с неопротерозоя около 1 млрд. лет назад, особенно в связи с распространением нитчатых водорослей в водоемах. В период господства цианобактерий целлюлозолитические организмы имели ограниченный источник субстрата. У бактерий процесс освоения нового субстрата шел за счет латерального переноса генов на основе самых разнообразных филогенетических ветвей. Гидролитическая активность есть типичный пример подготовительного метаболизма. Вопрос состоит в совместимости с морфо-физиологическими особенностями. Особенно подходящими оказались организмы со скользящим движением, способные двигаться по поверхности твердого субстрата, как цитофаги, и с мицелиальным строением, как актиномицеты.

Основной группировкой наземных организмов, ориентированной на разложение твердой фазы растительного вещества - оболочки клетки, являются эукариотные мицелиальные организмы. Грибы в целом представляют группировку, трофически ориентированную на разложение твердой фазы растительного органического вещества в субаэральных условиях. Подавляющая масса грибов, так или иначе, связана с разложением растительного материала либо как сапрофиты, либо как паразиты. К этому следует добавить симбиотические отношения грибов микоризы с корневой системой растений.

Итак, в целлюлозолитический маршрут входят следующие группировки:

1) гидролиз целлюлозы грибами “бурой гнили” осуществляется очень широким кругом аэробных организмов, составляющих важнейшую часть группировки сапрофитных грибов и некоторых фито-патогенных;

2) аэробные бактерии с характерной группировкой цитофаг;

3) анаэробные бактерии с характерной группировкой клостридий; гидролиз целлюлозы археями пока неизвестен в противоположность участию термофильных архей в протеолитическом пути.

4) аэробные сахаролитические диссипотрофы, как, например, простекобактерии, но также многочисленные органотрофные организмы;

5) анаэробные сахаролитические диссипотрофы, как, например, спирохеты, но также очень многочисленные сахаролитические анаэробы, образующие трофическую систему в метаногенном сообществе с последовательным использованием продуктов обмена трофических предшественников.