	Главная \| Случайная страница \| Контакты \| Мы поможем в написании вашей работы!

Применение иммобилизованных ферментов и белков в медицине открывают новые перспективы создания эффективных лекарственных средств

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 13

GLP - (Good Laboratory Practice) - хорошая лабораторная практика - правила организации

лабораторных направлений.

GCP - (Good Clinical Practice) - хорошая клиническая практика - правила организации

клинических испытаний.

GMP - (Good Manufacturing Practice) - хорошая производственная практика - правила

организации производства и контроля качества лекарственных средств, это единая система

требований к производству и контролю.

Правила GMP - это руководящий, нормативный документ, которому и производство и фирма

обязаны подчиняться.

Правила GMP обязательны для всех предприятий, выпускающих готовые лекарственные

формы (ГЛФ), продукцию медицинского назначения, а также субстанции.

Самые жесткие требования предъявляются к инъекционным лекарственным препаратам.

В 1969 году около 100 государств в мире заключили многостороннее соглашения между собой. «Система удостоверения качества фармацевтических препаратов в международной торговле». Система была введена под эгидой Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ). Эта система была введена для оказания помощи органам здравоохранения импортирующих стран в оценке технического уровня производства и качества закупаемых ими лекарственных препаратов. В последующие годы эта система многократно пересматривалась.

Система дает выгоды импортерам. Эта система дает преимущества и экспортерам (высокоразвитые страны), когда препараты идут на экспорт без лишних препятствий.

К экспортерам лекарственных средств предъявляются следующие требования:

1. В стране должна быть государственная регистрация лекарственных средств.

2. В стране должно быть государственное инспектирование фармацевтических предприятий.

3. В стране должны быть приняты правила GMP.

Подобно Фармакопеям правила GMP неоднородны. Имеются:

• Международные правила GMP, принимает и разрабатывает Всемирная Организация
Здравоохранения (ВОЗ),

• Региональные - страны европейского экономического сообщества (ЕЭС),

• Правила GMP ассоциации стран Юго-Восточной Азии,

• Национальные правила GMP приняты в 30 странах мира.

Международные правила GMP по строгости требований усреднены, в ряде стран правила более либеральные (в соответствии с техническим уровнем производства). В Японии национальные правила GMP строже международных.

Правила GMP имеют 8 разделов

I Терминология

П. Обеспечение качества

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Ш. Персонал

IV Здания и помещения

V Оборудование

VI Процесс производства

VII Отдел технического контроля (ОТК)

VIII Валидация (утверждение)

8-ой раздел: валидация

Валидация - это оценка и документальное подтверждение соответствия производственного

процесса и качества продукции установленным требованиям.

Директор предприятия специальным приказом назначает руководящего сотрудника или

специалиста со стороны для проверки качества работы какого-либо цеха, технологической

линии и т.д.

Валидация может быть

- периодическая,(проводится постоянно)

- внеплановая (при чрезвычайных происшествиях, при изменении технологии).
Валидация позволяет установить:

- соответствует ли технологический процесс регламенту

- соответствует ли качество готовой продукции требованиям нормативной технологической
документации

- соответствует ли оборудование производственным целям

- каков предел возможности производственного процесса
Валидация оценивает:

- сам процесс

- предел возможных отклонений

При этом составляется отчет, если имеются какие либо не соответствия или нарушения - то

производственный процесс прерывается.

На биотехнологическом производстве внеплановая валидация проводится если:

- производство меняет штамм продуцента

- изменена питательная среда (так как изменяется метаболизм продуцента и он может давать
примеси).

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 14

GLP - правила организации лабораторных исследований

Новое лекарственное средство необходимо подвергнуть лабораторным испытаниям, прежде чем приступать к проведению клинических испытаний.

Лабораторные испытания (in vitro, in vivo) проводятся на клетках, бесклеточных системах и животных.

При испытании на животных можно получить различные результаты, поэтому важна правильная организация исследований.

Животные должны быть гетерогенны (разные), корм должен быть постоянным, одинаковым; требуется определенная планировка вивария, чтобы исключить стресс у животных; животные должны быть жизнеспособны. GCP - правила организации клинических испытаний

Лекарственное средство допускается к клиническим испытаниям только после проведения лабораторных испытаний.

В правилах GCP изложены права больных и добровольцев:

- испытуемые должны быть информированы о том, что им вводится новый лекарственный
препарат и о его свойствах

- больные имеют право на финансовое вознаграждение

- должен быть контроль за ходом испытаний со стороны медиков.

В Европе, Соединенных Штатах Америки (США) и России введены общественные комитеты по контролю за клиническими испытаниями лекарственных препаратов. В эти комитеты входят священники, представители милиции и прокуратуры, медицинской общественности, которые наблюдают за испытаниями лекарственных препаратов.

Цель клинических испытаний - получение достоверных результатов: лекарство лечит, оно безвредно и т.д.

Здесь мы в очень краткой форме подчеркнем только два аспекта правил GCP - соблюдение максимальной безопасности для испытуемых и достижение максимальной достоверности результатов, получаемых на пациентах.

Признается обязательным, чтобы те, кому вводится новый (внедряемый в клинику) препарат, были бы проинформированы об этом. Они могут иметь дополнительную информацию, в том числе и о праве на возмещение ущерба их здоровью в чрезвычайных случаях. На внедрение нового, апробируемого в клинике препарата должно быть получено согласие пациента. Детям, за исключением специальных случав, препараты такого рода вводить запрещено.

В последние годы за рубежом и в России внедряется новая форма защиты прав пациентов. Организуются этические (общественные) комитеты, не подчиненные администрации лечебных учреждений, где проводятся испытания. Функции этических комитетов ограничиваются контролем за соблюдением прав лиц, получающих новые препараты (в соответствии с правилами GCP). Рекомендаций, относящимся к схемам и режимам лечения, этические комитеты не дают, хотя в их состав могут входить медики (непосредственно в

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

испытаниях не участвующие). Помимо медиков в составе этических комитетов целесообразно иметь на общественных началах юристов, священнослужителей, представителей административных кругов и т.д.

Не столь простым является вопрос о достоверности результатов клинических испытаний. Одна из проблем - это исключение влияния личной заинтересованности тех, кто испытывает препарат.

Причины такой заинтересованности различны, например, давление разработчиков препаратов, фирм владельцев данных препаратов и др. Одним из путей повышения достоверности клинических испытаний выводов является объединение материала, получаемого коллективами исследователей, независимыми друг от друга. В этом случае уменьшается вероятность необъективности. Объединение и использование материала, полученного, например, в пяти клиниках (по сто случаев применения в каждой) позволяет сделать более достоверный вывод об эффективности и безопасности препарата, чем материал, полученный на том же количестве больных в рамках одного учреждения. Разумеется, это лишь один из примеров путей проведения клинических испытаний в соответствии с правилами GCP. Проведение клинических испытаний фармпрепаратов регламентируется, в целом, большим количеством взаимосвязанных документов.

Изучение, испытание и производство фармацевтического препарата в настоящее время регламентируются и новый препарат проходит указанные стадии, находясь непосредственно под контролем правил вначале GLP, затем GCP и, наконец, GMP.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 15.

Плазмиды - носители генов информации (всего около 30 генов). Плазмиды автономно реплицируются (размножаются) независимо от деления клетки. Плазмиды могут содержать гены резистентности (устойчивости) к разным антибиотикам. Плазмиды с генами резистентное™ легко передаются из клетки в клетку при конъюгации микроорганизмов. При этом двойная нить плазмиды расходится на две отдельные нити и одна остается в клетке донора, а другая передается реципиенту. Особенно часто это явление наблюдается в больницах (внутрибольничная инфекция). Коньюгация м/о может быть не только внутривидовой, но и межвидовой и даже межродовой; возможна «вспышка» - вся микрофлора может стать резистентной к антибиотикам. Схема развития плазмидной резистентности. Первоисточник генов резистентности находится в почве у почвенных микроорганизмов — продуцентов антибиотиков. Они могут передаваться через промежуточных хозяев патогенным микроорганизмам.

Борьба срезистентностью микроорганизмов.

1. Р-лактамы инактивируются Р-лактамазами, которые расщепляют их Р-лактамное
кольцо. Основной путь борьбы с Р-лактамазами - создание молекул, которые не
захватываются активным центром Р- лактамаз. Создают полусинтетический антибиотик
(например, оксациллин или метициллин), которые не чувствительны к пенициллазам.

Механизм создания полусинтетических пенициллинов:

а) отщепление бензильного радикала (остается о-аминопенициллановая кислота - 6АПК).

б) введение других радикалов химическим путем.

Так же идет работа с цефалоспоринами: радикалы присоединяют к 7-аминоцефалоспориновой кислоте (7АПК).

После того как новые антибиотики внедряются в практику, они становятся селективным фоном отбора для резистентности микроорганизмов, таким образом постепенно создаются резистентные штаммы.

2. Создание ингибиторов Р-лактамаз, созданы комбинированные препараты, содержащие
антибиотик и ингибитор Р-лактамаз.

Уназин (ампициллин + сулъбактам - ингибитор пенициллазы). Амоксиклав (амоксиииллин + клавулановая кислота - ингибитор пениииллазы). Аугментин (амоксиииллин + клавулановая кислота но в другом соотношении). Резистентность может существовать также за счет генов клетки

У некоторых клеток есть гены, которые делают мембраны непроницаемыми для антибиотиков (сужаются поры или снижается их количество). Способы борьбы с этой резистнтностью h Создан Р-лактамный антибиотик Имипипсм, который в растворе образует цвиттер-ион,

меньший по размерам, чем пенициллин и легко проникает через узкие пориновые

каналы. 2± Могут быть созданы структуры, которые проникают не через пориновые каналы, а

другим способом, например, с помощью имитации структуры переносчика. Есть

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

цефалоспорин, имитирующий переносчик железа и, попадая в клетку, он угнетает синтез пептидогликана, ингибируя транспептидазу).

-цефалоспорины Ш поколения не расщепляются Р-лактамазами, но они являются индукторами выработки Р-лактамаз,

- цефалоспорины 1У поколения (Цсфспим) не являются индукторами Р-лактамаз. 3^ аминогликозидный антибиотик Амикацин имеет фрагмент гаммаоксимасляной кислоты в структуре канамицина защищающий этот антибиотик от инактивации со стороны изоферментов этого антибиотика, поэтому этот антибиотик отличается высоким терапевтическим эффектом. Теория взаимозаменяемости антибиотиков.

В настоящее время есть 4 группы антибиотиков широкого спектра действия ф-лактамы, аминогликозиды, фторхинолоны тетрациклины). Если попробовать запретить применение одной группы (например, группы №1) антибиотиков, то резистентность к ним исчезает через 10 лет. После возобновления применения 1-ой группы, запрещают применение 2-ой группы и т.д.

Но сейчас нельзя исключить ни одной группы антибиотиков из практики лечения, так как достаточно активных и безопасных антибиотиков еще не хватает и требуется создавать новые и новые группы,.но, со временем, наверное, можно применить такую схему чередования разных групп антибиотиков для повышения терапевтического эффекта. О хромосомной и плазмидной локализации структурных генов беталактамаз. Гены беталактамаз, особенно цефалоспориназ, локализуются в бактериальной хромосоме. Однако, все чаще их обнаруживают и в плазмидах. Плазмиды не находятся под столь строгим регуляторным контролем в клетке как хромосомный генетический материал и могут существовать во многих копиях, что повышает количество генов беталактамаз и уровень самих ферментов в клетке.

Между хромосомами и плазмидами нередко с участием особых генетических элементов -транспозонов, происходит обмен генами, в частности, генами беталактамаз. Это делает понятия "хромосомная беталактамаза" и "плазмидная беталактамаза" в определенной мере условными. Наиболее важно то обстоятельство, что гены беталактамаз, локализованные в плазмиде, могут передаваться при конъюгации вместе с плазмидой в другую клетку. Это означает, что плазмидные гены быстро распространяются по клеточной популяции, для чего не нужно даже деления клеток. Возможен и межвидовой перенос плазмидных генов беталактамаз, например, из клетки кишечной палочки в клетку сальмонеллы и т.п.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 16.

Метод биотехнологии получения ЛС на основе культур клеток растений, начинается с процесса получения культуры каллусной ткани или каллуса.

Впервые каллусная культура была получена в 1902 году Культура каллусной ткани состоит из сообщества клеток, выращиваемых на искусственной питательной среде

Тотипотентность - это способность любой клетки образовывать полноценное растение, что предопределено его генетическим и физиологическим потенциалом (или естественными возможностями), необходимым для образования вторичных метаболитов. Стабильность по выходу продукта вторичных метаболитов связывают с двумя параметрами:

1. с дифференцировкой клеток,

2. со стадией культивирования

Например, дифференцированные корневые каллусы Atropa belladonna синтезируют тропановые алалоиды, а недифференцированные уже не способны к их синтезу Но с другой стороны Rauwolfia serpentina способна синтезировать индолиловые алкалоиды недифференцированными клетками с достаточно большим выходом метаболитов. Отсюда можно сделать вывод, что морфологическая специализация клеток не является основной предпосылкой БАВ, т.е. здесь нет прямой связи.

Каллус (от латинского callus- толстая кожа, мозоль), представляет ткань, которая образуется в местах повреждения органов растения и обычно возникающая при неорганизованной пролиферации клеток растения (дедифференцированное деление клеток). Используется для получения изолированных тканей и клеток растения и определяет явление каллусогенеза. Морфогенез - это дифференцированное деление клеток (клетки специализированы и соответствуют какой-либо структуре клеточной ткани растения).

Технология получения каллуса- Выбранный эксплантант, представляющий вырезанные маленькие кусочки (2-4 мм) растительной ткани, которые находятся в подходящем биологическом состоянии (они молоды, здоровы), что необходимо для получения каллусных культур. Этот растительный материал тщательно моют, стерилизуют гипохлоридом натрия, 96% спиртом или 0,1% сулемы, затем тщательно промывают дистиллированной водой и помещают на синтетическую агаризованную питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами. Конечно, при этом необходимо соблюдать строгие правила антисептики (работают только в боксах). Для образования каллуса и роста ткани сосуды переносят в темное помещение, где строго поддерживают определенный режим. Это касается температуры и влажности. Известно, что для большинства культур эти параметры таковы: температура +24-26 °, а влажность 65-70%. Через 2-3 недели на раневой поверхности образуется первичный каллус.

Весьма существенным в вопросе обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма является подбор ингредиентов среды культивирования, что определяется конечной целью биотехнолога. Это:

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

формирование биомассы,синтез вторичных продуктов, приготовление оборудования, приготовление питательной среды, стерилизация питательной среды, посев ткани на питательную среду, выращивание биомассы, съем сырой биомассы и высушивание. Состав питательной среды: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, органические добавки - витамины, источники углерода, органические добавки - регуляторы роста растений -ауксины и цитокинины (играют роль пусковых механизмов). Культивирование ведется на жидких и твердых питательных средах.

Факторы, от которых зависит накопление вторичных метаболитов в процессе культивирования растительных клеток. Первый фактор.

1. Регуляторы роста растений как мы уже говорили, являются пусковыми механизмами первичного и вторичного метаболизма, влияя таким образом на потенциал продуктивности культур клеток. В качестве регуляторов роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма выступают

ауксины (индолилтриуксусная кислота (ИУК), нафтилукссная кислота (НУК) и 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д) и

цитокинины -6-бензиламинопурин (БАП), N-изоптен и 6-фурфуриламинопурин (кинетин) Что касается цитокининов, то они по разному влияют на накопление вторичных метаболитов- одни не реагируют на внесение в среду кинетика, а другие культуры клеток при этом начинают образовывать например, алкалоиды (на примере культуры клеток в первом случае Datura tatula и во втором случае, Scopolia maxima) Таким образом, существование цитокининзависимых и цитокининнезависимых клеток, если связывать это с природой самого растения, зависит от изменений в фенотипе (внешних), а не в генотипе (внутренних) культуры клеток.

Второй фактор.

Для синтеза вторичных метаболитов весьма существенным является внесение в питательную среду известных предшественников, стимулирующих определенные ферментативные пути метаболизма. Например, внесение всем известного фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивает выход диосгенина на 100%

Третий фактор.

Накопление вторичных метаболитов также зависит от температуры, рН, а при суспензионном культивировании от аэрации, перемешивания, скорости вращения сосудов, от газового состава и т.д.

Таким образом, если мы хотим иметь гарантию возможности получения любого продукта с фармакологической активностью, мы должны иметь в виду наиболее благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов для каждой культуры клеток растений (т.е. знать ее характер, капризы, требования, наконец саму природу на уровне фенотипа и генотипа). Итак мы уверены, что промышленное производство может эффективно работать, реализуя возможность накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений, используя каллусные и суспензионные культуры (помня, что суспензионные культуры получают из каллусных).

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В литературе приводятся интересные данные по технологии получения субстанции женьшеня, радиолы розовой и унгерии на основе каллусных культур. Кстати, известно, что препараты женьшеня широко применяются в косметической, пищевой, медицинской промышленности.

Если сравнивать преимущества каллусных культур и суспензионных между собой, то оказывается, что выход продуктов вторичного метаболизма выше именно в каллусных культурах, но управление процессом культивирования легче осуществлять при работе в суспензионных культурах.

При производстве настоек женьшеня, плантационное выращивание этой культуры в количественном отношении по выходу панаксозидов имеет преимущество перед каллусным сырьем, но по токсичности, препараты, получаемые из каллусного сырья менее опасны. Четвертый фактор.

Рентабельность производства на примере женьшеня стала преобладать в технологии получения «бородатых корней», где по условиям роста и скопления клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференцировкой - это самые продуктивные клетки по биоактивным веществам. Биотрансформация - это метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения и способные менять функциональные группы добавленных из вне химических соединений. Метод используется для повышения биологической активности конкретной химической структуры и проведения серий специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов. В качестве примера можно привести превращение дигитоксина в дигогсин клетками Digitalis lanata.

Недеференцированные культуры клеток Digitalis lanata сами не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду.

Биотрансформация дигитоксина в дигогсин идет за счет реакции 12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, находящимся в клетках Digitalis lanata.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 17

Некоторые генетические аспекты различных механизмов антибиотикорезистентности.

Формирование в бактериальной клетке перечисленных выше защитных механизмов обусловлено появлением «генов резистентное™» не только в хромосоме. Большое внимание привлекают и внехромосомные (плазмидные) генетические элементы микробной клетки, представляющие собой кольцевые молекулы ДНК, имеющие размер в сотни раз меньший, чем хромосомы.

Плазмиды, несущие гены резистентное™ к антибиотикам, получили название R плазмид (более старый термин R факторы). Основная опасность плазмидной резистентности в генетическом плане в том, что плазмиды передаются из клетки в клетку путем конъюгации (аналог полового процесса) без деления клетки, однако, плазмида при этом реплицируется. Таким образом, одна клетка может быстро передать резистентность большому количеству клеток. Этому способствует и то обстоятельство, что некоторые типы плазмид многокопийны. Возник даже термин «инфекционная резистентность», то есть «заражение резистентностью» одних клеток от других.

Плазмидная резистентность редко встречается лишь в случае первого из перечисленных выше механизмов резистентности. Причиной антибиотикорезистентности, вызванной изменением конформации внутриклеточной мишени, являются спонтанные мутации в структурном гене, то есть в гене, определяющем структуру той макромолекулы, с которой как с мишенью связывался антибиотик. В результате таких мутаций меняется аминокислотная последовательность в ферменте или в рибосомном белке, что ведет и к изменению конформации молекулы, перестающей связывать антибиотик. Причина появления изоферментов с беталактамазной активностью в том, что микробная клетка защищает себя от антибиотиков за счет мутаций в гене, кодирующем последовательность аминокислот в ферменте-мишени, то есть в «структурном» гене этого фермента. Происходит расщепление беталактамного кольца и антибиотик теряет свою активность.

Мутировавшие хромосомные гены могут быть, согласно принятому термину,
«мобилизованы», то есть оказаться в плазмидах и быть переданы за счет механизмов
распространения плазмид, в другие клетки. Однако, переноса резистентности при этом, в
большинстве случаев не происходит. В новой клетке - хозяине будут работать
(экспрессироватъся) как свои хромосомные так и чужие (плазмидные) структурные гены и, в
результате, часть мишеней для антибиотика будет «чувствительной» к нему, то есть будет его
связывать, а часть - резистентной. В таких случаях антибиотикочувствительность доминирует
над антибиотикорезистентностью. Именно поэтому при выявлении резистентности за счет
изменения конформации мишеней, гены резистентности оказываются локализованными в хро
мосомах. Транспозоны представляют генетические элементы ДНК, способные
самостоятельно перемещаться в пределах репликона (генома), а также к перемещению из одного
репликона (хромосомного, плазмидного, фагового)в другой. Многие транспозоны при этом
перемещении несут детерминанты устойчивости к антибиотикам (например, к канамицину,

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

хлорамфениколу, тетрациклину, эритромицину. При встраивании в ген транспозонов, несущих детерминанты устойчивости к антибиотикам, появляются мутанты с двойным фенотипом. Во-первых, инактивация гена сопровождается утратой функции, которую он контролирует. Во-вторых, экспрессия генов этого транспозона приводит к лекарственной устойчивости. Практически теряется терапевтическая активность антибиотиков.

Исключения здесь связаны с теми случаями, когда изменения конформации мишени происходят не вследствие мутации в ее структурном гене, а в результате ферментативной модификации уже синтезированной мишени. Ген фермента модифицирующего мишень может иметь не только хромосомную, но и плазмидную локализацию. Особенно часто плазмидная локализация генов резистентности встречается при ферментативной инактивации антибиотитиков. Иногда в одной плазмиде оказываются локализованными несколько генов, кодирующих ферменты, воздействующие на антибиотики разных групп. Отсюда возникло понятие полирезистентности микроорганизмов. Полирезистентные штаммы возбудителей инфекций представляют серьезную проблему в инфекционной клинике, вызывая так называемую «госпитальную инфекцию», когда к тем антибиотикам, которые используют в инфекционной клинике возникает устойчивая резистентность со стороны возбудителей различных инфекционных заболеваний и лекарственные препараты - антибиотики теряют свою активность.

Механизмы антибиотикорезистентности. Ферменты, вызывающие инактивацию антибиотиков аминогликозидной структуры.

Ферментативная инактивация аминогликозидов - наиболее часто встречающийся механизм резистентности к этим антибиотикам. Представляет интерес то обстоятельство, что ферменты, инактивирующие аминогликозиды, несмотря на предположения о их существовании, долгое время обнаружить не удавалось. Этому способствовали два обстоятельства, отличающие их от беталактамаз. Во-первых, они не являются гидролазами, то есть их активность выявляется не просто в водной среде, а требует для своего проявления более сложной реакционной смеси.

Во-вторых, если часть беталактамаз, (беталактамазы грамположительных микроорганизмов) относится к внеклеточным ферментам, что облегчает их обнаружение, то ферменты, катализирующие инактивацию аминогликозидов, практически всегда имеют только внутриклеточную локализацию (за исключением некоторых специально полученных лабораторных штаммов мутантов).

Все это привело к тому, что бактериальные ферменты, воздействующие на аминогликозиды, удалось обнаружить лишь спустя два десятилетия после внедрения в медицинскую практику стрептомицина - первого ставшего известным аминогликозидного антибиотика. Для сравнения: пенициллаза была открыта спусти два-три года после начала систематических работ с пенициллином.

Ферменты, инактивирующие аминогликозидные антибиотики, относятся по современной номенклатуре и классификации ферментов, к классу трансфераз. Это означает, что они не расщепляют молекулу аминогликозидных антибиотиков, а переносят (transfer) на нее определенные фрагменты, а именно, катализируют замещение гидроксильных групп у аминогликозидов остатками фосфорной или адениловой кислоты, а аминогруппы аминогликозидов замещают остатками уксусной кислоты.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Таким образом, инактивирующие аминогликозиды ферменты, это: - фосфотрансферазы, аденилтрансферазы, ацетилтрансферазы

Важнейшее свойство данных ферментов, которое должно быть обязательно отмечено: каждый фермент, за самыми редкими исключениями, катализирует замещение только одной функциональной группы в молекуле аминогликозидного антибиотика. Однако, этого достаточно для потери антибиотиком своей активности.

Активный выброс антибиотиков, на примере тетрациклиновых обнаруживает новые белки в цитоплазматической мембране, представляющих систему активного «выброса» тетрациклинов, проникших в клетку, что делает применение данных антибиотиков неэффективным. Эта система белков включает в себя «белок-ловушку», «линкерный белок» и «белок-помпу».Такая же ситуация наблюдается в отношении противоопухолевых антибиотиков, с чем связывают их недостаточную эффективность в лечении различных онкологических заболеваний.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 18

Антибиотики являются веществами, которые вырабатываются одними м/о и подавляют рост других м/о или опухолевых клеток.

Полусинтетические антибиотики - это природные антибиотики, модифицированные ферментативным или химическим путем. Ъ-лектамные антибиотики. - пенициллины -цефалоспорины.

На основе chrysogenum получены полусинтетичесие антибиотики из пенициллина -полусинтетические пенициллины: оксациллин, карбенициллин; из цефалоспорина С -цефалоспорины I,II, III, IY поколения.

Первичные метаболиты (предшественники) Ъ-лектамных антибиотиков - три аминокислоты: цистеин, валин, аминоадипиновая кислота.

Продуцентами пенициллинов и цефалоспоринов являются грибы.

Penicillum chrysogenum (пенициллины)

Acremonium chrysogenum (цефалоспорины).

Грибы - это организмы, которые имеют ядра, митохондрии, клеточную стенку, содержащую хитин, имеют сложный цикл развития. Помимо антибиотиков грибы используют для получения иммунодепрессанта - циклоспорина (продуцент - Tolypocladium inflatum), фузидина - антибиотика, в основе которого лежит стероидное ядро сердечных гликозидов (продуцент - гриб Fusidium coccineum). Дрожжи являются продуцентами витаминов и ферментов.

Механизм действия) Ъ-лектамных антибиотиков. Они ингибируют синтез пептидогликана клеточной стенки на последнем этапе, подавляя активность фермента транспептидазы. Транспептидазы соединяют концы пептидных цепочек, на концах которых находится D-аланин, а Ъ-лектамные антибиотики являются аналогами D-аланина и связываются с активным центром фермента, тем самым инактивируя его. В результате пептидные цепочки не замыкаются.

Актипомицсты - это многоклеточные бактерии. Актиномицеты не имеют ядра (вместо ядра имеется одна замкнутая нить ДНК), т.е. актиномицеты - прокариоты, не имеют митохондрий, имеют сложный цикл развития.

Всего имеется 12 тысяч природных антибиотиков, из них 9 тысяч антибиотиков продуцируют актиномицеты. Актиномицеты продуцируют антибиотики, ингибирующие синтез белка на рибосомах бактериальных клеток. Такой же механизм у противогрибковых и противоопухолевых антибиотиков. Актиномицеты продуцируют следующие группы антибиотиков:

Аминогликозиды - ингибируют синтез белка у бактерий, связываясь с малой рибосомной субъединицей, нарушая правильность считывания кодонов информационной РНК (иРНК) антикодонами транспортной РНК (тРНК). -канамицин - Actinomyces kanamycetus -неомицин - Actinomyces iracie.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Тетрациклины ингибируют белковый синтез, связывая аминоацил -тРНК с рибосомно-матричным комплексом, -окситетрациклин - Actinomyces ninesus/

макролиды гр. эритромицина - связываются с большой субъединицей рибосомы, пиранозиды (группы линкомицина - сходны с макролидами, они связываются с большой субъединицей рибосомы.

- линкомицин - Streptomyces linconiensis/

левомицетин (получают химическим путем) - ингибирует пептилтрансферазу большой

рибосомальной субъединицы.

Природный левомицетин (хлорамфеникол) продуцируется Streptomyces venezuelae.

Рифамицин - Streptomyces mediterranei, на основе рифамицина получен рифампицин.

Рифампицин подавляет активность ДНК-зависимую РНК-полимеразу и тем самым

блокирует синтез белка на уровне транскрипции.

противогрибковые - (полиеновые) антибиотики - образуют поры в цитопластической

мембране грибов, взаимодействуя с ее стерольным компонентом (эргостеролом). (рис.)

- нистатин - Streptomyces noursei

- леворин - Actinomyces levorus

- амфотерцин - Streptomyces nodosus

противоопухолевые антибиотики - угнетают синтез нуклеиновых кислот клеток микро- и макроорганизмов.

- брунеомицин - Actinomyces albusvar bruneomycini

- митомицин - Streptomyces caespitosus.

Бактерии - также способны к образованию антибиотиков. Образуют антибиотики и большинство бацилл, которые являются спорообразующими бактериями. В медицине применяют полимиксины, продуцируемые спорообразующими почвенными бактериями Bacillus polymyxa.

Полимиксины (полимиксин, грамицидин) по химическому строению являются сложными

соединениями, включающими остатки полипептидов. Они нарушают развитие

цитоплазматической мембраны у бактерий, повышают ее проницаемость.

Особые требования к биотехнологическому производству должны соблюдаться в

антибиотической промышленности. Учитывая аллергенность беталактамных структур,

рекомендуется производственные процессы, связанные с производством пенициллина и его

производных, осуществлять в отдельных помещениях. Пенициллин по сравнению со многими

другими выпускаемыми промышленностью антибиотиками мало токсичен. Однако,

аллергенность, как известно, проявляется при исключительно малых концентрациях вещества

(если, конечно, оно обладает таким свойством). Поэтому микроколичества пенициллина при

попадании в препараты других антибиотиков и вообще в другую продукцию реально могут

вызвать нежелательные последствия.

Следует здесь же отметить, что меры предосторожности при работе с пенициллином относятся и к технологическому оборудованию (пятый раздел правил GMP, начиная с цеха ферментации, цеха химочистки и так далее). Для работы с пенициллином рекомендуется использовать отдельные емкости, трубопроводы и т.п.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 19

Ингибиторы образования клеточной стенки бактерий.

Ингибирование происходит вследствие избирательного подавления активности тех или иных ферментов, включенных в многоэтапный синтез основного полимера клеточной стенки - пептидогликана. В число ингибиторов синтеза пептидогликана входят важнейшие по своему значению для медицинской практики пенициллины, цефалоспорины и другие вещества беталактамной структуры.

Пептидогликан в соответствии со своим названием состоит из принципиально разных частей. Его длинные, параллельно расположенные по отношению друг к другу гликановые нити построены из перемежающихся остатков двух Сахаров: N-ацетилглюкозамина и мурамовой кислоты. Мурамовая кислота является эфиром N—ацетилглюкозамина и молочной кислоты (ее название происходит от греч. mums - стена, так как впервые она была обнаружена в клеточкой стенке бактерий).

Пептидная часть полимера состоит из коротких пептидных цепочек (3-5 аминокислотных остатков), отходящих от остатков мурамовой кислоты в гликане.

Пептидные цепочки, ответвляющиеся таким образом от параллельных гликановых нитей, замыкаются друг с другом за счет пептидной связи. Между параллельными нитями гликана образуются поперечные пептидные «мостики» и формируется завершенный или целостный пептидогликан, который жесткой «сетью» охватывает всю бактериальную клетку.

Грамположительные бактерии имеют толстый слой пептидогликана; у грамотрицательных -

он гораздо тоньше.

Беталактамные антибиотики (все без исключения) во время биосинтеза пептидогликана

подавляют катализируемое ферментами замыкание пептидных цепочек в пептидные мостики.

Гликановые нити остаются разъединенными; формирования непрерывной сети

пептидогликана, охватывающей клетку, не происходит. Это означает, что пептидогликан

теряет свои свойства, жизненно необходимые бактериальной клетке.

Бактериальные клетки делятся, увеличиваются в размерах, вновь делятся и т.д., а это требует постоянного синтеза пептидогликана и «вставки» вновь синтезированных фрагментов в полимер, который для этого «разрезается» специфическими гидролазами пептидогликана. В нормальных условиях в клетке сохраняется баланс между действием ферментов, гидролизующих пептидогликан и синтезирующих его. В присутствии беталактамных антибиотиков этот баланс нарушается. Прекращается синтез пептидогликана, но его ферментативный гидролиз продолжается и даже усиливается из-за того, что клеточная стенка теряет некоторые компоненты, «сдерживающие» их активность путем обратимого блокирования гидролаз. Гидролизуются и гликановые нити, и пептидные мостики.

Причина появления изоферментов с беталактамазной активностью в том, что микробная клетка защищает себя от антибиотиков за счет мутаций в гене, кодирующем последовательность аминокислот в ферменте-мишени, то есть в «структурном» гене этого фермента. Появляется возможность расщепления беталактамного кольца и антибиотик теряет свою активность.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Мишенями в клетке для пенициллинов и цефалоспоринов являются ферменты транспептидазы и D,D -карбоксипептидазы, которые катализируют последние реакции сложного процесса синтеза полимера клеточной стенки бактерий - пептидогликана.

Беталактамное кольцо в молекуле антибиотиков, подавляющих активность транспептидаз и -D,D карбоксипептидаз, имеет сходство с одной из стереоформ, которые принимают попавший в активный центр свободный конец пептидных цепочек, являющийся Б-аланил-Б-аланином. Попав в активный центр ферментов-мишеней, беталактамный антибиотик после расщепления своего беталактамного кольца, ковалентно связывается с ферментом, ацилируя одну из гидроксильных групп в активном центре.

Сродство у различных беталактамных молекул к разным транспептидазам, получившим названии «пенициллин связывающие белки» (Penicillin bounding proteins) PBPs -1, PBPs- 2, PBPs- 3 и т.д., неодинаково. Поэтому, фактически неодинаков и механизм действия разных беталактамов. Все это непосредственно сказывается на лечебных свойствах беталактамных антибиотиков. Важность сведений по механизму действия антибиотиков,в частности, беталактамов для лечащего врача или фармацевта наглядно демонстрируется тем, что в самые короткие по тексту рекламные материалы, рассчитанные на широкие круги практических работников, зарубежные фирмы нередко вставляют строку: новый беталактам реагирует с таким-то «пенициллин связывающим белком» (конкретным РВР). К сожалению, наши специалисты мало знакомы с этим критерием, определяющим продолжительность антибиотического эффекта препарата, переносимость его определенными категориями больных и другие важные качества.

Известно, что в разных частях бактериальной клетки транспептидаза пептидогликана как белок неодинакова, с другой стороны, все многочисленные антибиотики имеют одинаковый механизм действия на патогенный микроорганизм, поэтому в рекомендациях по применению антибиотиков различного характера имеется информация по взаимодействию их с пенщиллинсвязывающими белками (PBPs). Эта рекомендация связана с иммунитетом человека, принимающего антибиотики. Если есть информация в рекомендациях по применению, что новый антибиотик связывается с PBPs-2, то это означает, что клетка микроорганизма будет активно лизироваться и освобождающиеся полисахариды в большом количестве будут поступать в кровь, что в свою очередь работает как пирогенный фактор и ведет к повышению температуры больного на короткое время. Такие антибиотики могут быть рекомендованы больным с невысоким уровнем иммунитета (например, это больные СПИДом). Если оке есть информация о PBPs-З, то это означает, что в результате действия такого антибиотика бактериальная клетка только временно перестает делиться, оставаясь живой и после отмены этого антибиотика, она начинает снова свое размножение с большой активностью и с опасностью возникновения новой инфекции. Для людей с низким иммунитетом применение таких антибиотиков опасно. Реализуя в продаже тот или иной антибиотик, вы должны предупреждать врачей о таком факте

Изложенное выше свидетельствует о необходимости знания основ механизмов действия антибиотиков как врачами так и фармацевтами.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 20

Потребность периодического обновления используемых в медицине антибиотиков обусловлена постепенным распространением в микромире вариантов резистентности к антимикробным препаратам. Постоянное применение в клиниках определенного географического региона конкретного антибиотика в течение 20-30 и более лет, приводит к тому, что резистентные к нему штаммы начинают обнаруживаться все чаще. Применяемые в медицине антимикробные антбиотики, непосредственно с геномом микроорганизмов не реагируют. Иными словами, они не являются мутагенами. Известно, однако, что в популяциях микроорганизмов происходят, хотя и редко (1:10 и т.п.) разнообразные «спонтанные» мутации отдельных генов, причины которых трудно уловимы. Образуются мутанты с отклонениями в метаболизме, с измененными субклеточными структурами. Нормальные клетки, являясь результатом длительной эволюции, хорошо приспособлены к окружающим их естественным условиям. Мутанты к таким условиям приспособлены хуже и, спустя определенный период времени после ряда генераций, исчезают, однако, если сама окружающая среда изменилась и изменения сохраняются в течение длительного времени, мутантные формы микроорганизмов могут оказаться лучше приспособленными к новым условиям, что и объясняет распространение такого разнообразия антибиотикорезистентных форм. Одни и те же антибиотики при их массовом и непрерывном применении играют роль селективных факторов отбора резистентных к ним мутантных микроорганизмов. В этом случае именно мутанты, обладающие резистентностью, реализуют свой потенциал. Исходные антибиотикочувствительные культуры такой возможности не получают даже в том случае, если их скорость размножения в свободной от антибиотиков среде выше, чем у мутантов. Спонтанные мутации - отнюдь не единственный источник генов резистентности. Как отмечалось, у продуцентов некоторых антибиотиков, например, аминогликозидов, существуют ферменты, модифицирующие или трансформирующие молекулу собственного антибиотика таким образом, что последний инактивируется. Гены, кодирующие ферменты инактивации, могут включаться в ДНК некоторых фагов, а иногда и в плазмиды и переноситься из продуцентов в клетки патогенных и непатогенных бактерий. Таким образом, попадание генов резистентности в патогенные микроорганизмы предопределено существованием в биоценозах самих продуцентов антибиотиков. Есть прямые доказательства того, что гены резистентности к антибиотикам и, соответственно, различные механизмы этой резистентности, существовали до рубежа 40х - 50х годов, то есть до того времени, когда стали применяться пенициллин, стрептомицин, левомицетин, тетрациклины. Музейные коллекций культур различных бактерий, хранившиеся с конца XIX века и не соприкасавшиеся с препаратами антибиотиков (музейные культуры пересевались 2-3 раза в год в боксах с особыми предосторожностями), содержат, хотя и редко, варианты, устойчивые к тем или иным антибиотикам. Например, у таких культур были обнаружены гены, кодирующие образование беталактамаз. Одна из основных причин, вызывающих потребность в создании и внедрении в медицинскую практику новых беталактамных антибиотиков - распространение среди патогенных микроорганизмов способности продуцировать ферменты, катализирующие расщепление беталактамного кольца у пенициллинов и цефалоспоринов, внедренных в медицинскую практику. Они получили название пенициллиназ

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

и цефалоспориназ в соответствии с их субстратной специфичностью и избирательностью действия на пенициллины или цефалоспорины.

Ферментативное расщепление (гидролиз) беталактамного кольца ведет к полной инактивации беталактамного антибиотика. Это было показано на примере бензилпенициллинов еще в 40-х годах Чейном впервые очистившим пенициллин (А. Флеминг, Э. Чейн и Г. Флори -микробиолог, химик к хирург - лауреаты Нобелевской премии, полученной за открытие и внедрение в медицинскую практику пеницилиллина). Пенициллановая кислота - продукт ферментативного расщепления бензилпенициллина полностью не активна. Это легко объяснимо, так как механизм действия беталактамных антибиотиков связан именно с расщеплением беталактамного кольца и ацилированием гидроксильной группы серина в активном центре ферментов-мишений. В случае же пенициллиназ и цефалоспориназ беталактамное кольцо также расщепляется и антибиотик быстро освобождается из активного центра этих ферментов с присоединением атома водорода и гидроксила. Пенициллиназы и цефалоспориназы относятся к ферментам гидролазам.

Наиболее часто встречающийся механизм тетрациклино-резистентности обусловлен изменениями, происходящими в оболочке, точнее в цитоплазматической мембране бактериальной клетки. Известно, что в клетках резистентных штаммов тетрациклины не накапливаются. При этом в цитоплазматической мембране обнаруживалось несколько новых белков, то есть белков, которые отсутствуют в мембране тетрациклиночувствительных штаммов.

Предполагалось, что эти белки блокируют пути транспорта тетрациклинов в клетку и делают ее тетрациклинорезистентной.

Позднее, однако, было отмечено, что новые белки, появляющиеся в цитоплазматической мембране при тетрациклинорезистентности являются белками, составляющими систему активного «выброса» тетрациклинов, проникающих в клетку.

Иными словами, тетрациклины проходят через оболочку бактериальной клетки, в том числе и через цитоплазматическую мембрану, однако, они не успевают прореагировать с рибосомами, так как быстро удаляются или «выбрасываются» в среду. Если при этом измерять (например, с помощью радиоизотопных методов, используя меченые тетрациклины) концентрацию тетрациклинов в клетке в любой отрезок времени, то концентрация окажется очень мала. Отсюда и следовал ранее сделанный ошибочный вывод, что тетрациклины в резистентную бактериальную клетку вообще не проникают. Химическая трансформация тетрациклинов.

Несмотря на многолетние исследования в этой области ряда лабораторий в разных странах, значительных успехов в получении практически ценных полусинтетических тетрациклинов достигнуто не было. В медицинскую практику было внедрено несколько продуктов химической трансформации природных тетрациклинов. Наиболее важным из них является доксициклин (6-дезокси-5-окситетрациклин). Доксициклин гораздо дольше циркулирует в организме, чем природные тетрациклины. В этом его преимущество перед ними. При внедрении в медицинскую практику миноциклина (7-диметиламино-6-метил-6-дезокситетрациклин), оказалось, что он обладал весьма незначительной активностью против штаммов бактерий, резистентных к природным тетрациклинам.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Механизмы резистентности к эритромицину.

Долгое время у резистентных к эритромицину (ингибитор белкового синтеза) штаммов бактерий обнаруживался только один механизм резистентности - на уровне рибосом. Рибосомы резистентных клеток не связывали эритромицин. В результате чего антибиотик теряет способность тормозить белковый синтез. Причиной этого являлось метилирование рибосомной РНК в большой субъединице бактериальной рибосомы. В резистентных клетках проявлялась активность специфической метилазы, которая катализировала введение одной-двух метальных групп в строго определенный остаток аденина в молекуле рибосомной РНК. В результате, менялась конформация всей большой рибосомной субъединицы. Эритромицин терял способность связываться с этой субъединицей и, вообще, с рибосомой. Следует отметить, что похожая метилаза была обнаружена и в клетках продуцента эритроминина - Streptomyces erythraeus. Рибосомы продуцента также не способны связывать вырабатываемый ими антибиотик, благодаря чему эритромицин не влияет на белковый синтез и, следовательно, на рост своего продуцента. Предполагается, что ген специфической метилазы У резистентных бактерий имеет первоисточником именно продуцент эритромицина. Недавно у разных штаммов бактерий обнаружены еще два механизма резистентности к эритромицину. В клетках некоторых штаммов был выявлен фермент, расщепляющий макроциклическое лактонное кольцо, что ведет к потере активности эритромицина. У других Бактериальных штаммов обнаружено еще два механизма инактивации - фосфорилирование или гидроксилирование по ОН-группе одного из присутствующих в молекуле Сахаров. Фосфотрансфераза, катализирующая фосфолирирование, по ее субстратной специфичности отличается от фосфотрансфераз, воздействующих на аминогликозидные антибиотики.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Задача 21

У патогенных микроорганизмов открыты гены, «существенные» для протекания инфекционного процесса, но не «существенные» при росте in vitro - на искусственных питательных средах. В последнем случае они ускользают от внимания исследователя, не поддаются идентификации и не могут быть использованы как таргеты при поиске лекарств. После того, как эти гены были отдифференцированы - такая возможность появилась. То есть, возможность наработки, согласно описанной выше процедуре, ДНК-матрицы, соответствующей информационной РНК, затем наработка генного продукта и, наконец, отбора ингибиторов функций этого генного продукта.

Скрытые или по образному выражению "молчащие" in vitro гены патогенных микроорганизмов получили название ivi генов (генов вирулентности), несмотря на то, что в их число входят не только гены, кодирующие образование токсинов, адгезинов и других факторов вирулентности. К ним относят также гены ферментов и транспортных белков, позволяющих патогенной микробной клетке жить и размножаться в тканях макроорганизма в условиях дефицита некоторых органических веществ и неорганических ионов. Можно привести такой пример: микробная клетка находясь in vivo, испытывает недостаток ионов железа, чего не бывает на обычных питательных средах. В этом случае в клетке синтезируется специальная система транспорта железа в клетку из среды с малой его концентрацией; фактически транспорт идет против градиента концентрации. Для образования такой системы необходима экспрессия определенных генов. Из молчащих («несущественных») они становятся «существенными», то есть подавление их функций отобранными ингибиторами приведет к подавлению роста (размножения) патогена именно в условиях in vivo, т.е. в инфицированном организме. Это, собственно, и есть цель исследователей, создающих новые лекарственные препараты.

К числу генов, становящихся «существенными» для патогена именно in vivo относятся гены, кодирующие оптимальный компонентный состав системы, а также недостаток в пуринах и их предшественниках.

Вышеизложенное, конечно, не означает, что во время инфекции в клетке патогена экспрессируются только ivi гены. Большинство генов экспрессируется и in vivo и in vitro. Их продукты необходимы клетке всегда. Такие гены получили образное название "house keeping gens", что означает, "гены, на которых держится дом". Эти гены экспрессируются в любых условиях, поскольку без них клетка просто не может существовать.

Также представляют значительный интерес пути выявления и выделения ivi генов с последующим их использованием в бесклеточных системах отбора ингибиторов. Работы в этом направлении ведутся в ряде лабораторий. В качестве примера приведем одну из таких работ. Ее авторы назвали свой метод FVET - данная аббревиатура означает In Vivo Expression Technology. Геном патогенной бактерии (в данном случае речь идет о штамме Salmonella typhi murium) с помощью большого набора рестриктаз делится на сотни фрагментов. Каждый отдельный фрагмент генноинженерными методами соединяется с лишенным промотора геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Такой, лишенный промотора ген, не может реплицироваться при его введении в клетку. Однако, он мог реплицироваться, если

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

соединенный с ним ген (подразумевается, что это фрагмент ДНК- салмонеллы) имел бы промотор для своей репликации.

Тогда, этот промотор, вызвал бы репликацию не только своего гена, но и репликацию следующего за ним гена, хотя и не имеющего промотора. Таким образом, репликация гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы могла происходить в клетке, только за счет использования или "захвата" чужого промотора.

На следующем этапе работы к этому сдвоенному фрагменту, (обозначенному x-cat, где х - фрагмент генома салмонеллы, a cat - ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы; далее присоединяется также лишенный промотора лактозный оперон (lac Z). Этот оперон нужен для системы окисления лактозы; в результате, генные инженеры получали фрагмент уже из трех частей: x-cat - lacZ. И этот фрагмент состоящий из трех разнородных частей, включался в плазмиду. Фактически в данном случае надо говорить, не об одном фрагменте, а о многих фрагментах, так как часть х, происходящая из генома салмонеллы, зависит от использованной рестриктазы и поэтому содержит разные участки генома.

Фрагменты x-cat - lacZ различаются именно по х. В результате, получился набор различных плазмид, а после введения их в клетку E.coli - набор различных штаммов E.coli с разными частями генома салмонеллы.

Следующий этап работы заключался во внедрении E.coli в организм лабораторного животного (мыши) и введении животному хлорамфеникола. Спустя сутки из ткани животного высевалась бактериальная культура, причем высев производился на твердую индикаторную среду с лактозой. Анализировались (визуально) выросшие колонии. Они оказывались или красного цвета (окисляющие лактозу, меняющие рН) или - белого (бесцветные). Красные доминировали, их было свыше 90%. Однако, отбирались и подвергались дальнейшему изучению именно белые. Ход рассуждений в данном случае был следующим. Если из животного, которому ввели хлорамфеникол высеялась жизнеспособная клетка, давшая колонию на твердой среде, значит в этой клетке экспрессировался ген хлорамфеникол- аетилтрансферазы и образовывался, соответственно, фермент, инактивирующий (ацетилирующий) антибиотик. Следовательно, в данном фрагменте х - есть ген с промотором. Этот ген экспрессировался в организме животного, а вслед за ним экспрессировался и ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (лишенный, напомним, собственного промотора). Но, экспрессироваться мог ген, принадлежащий как к ivi генам, так и к house keeping gens. Однако, это еще не позволяет "поймать" ivi ген и утверждать, что в фрагменте х именно один из таких генов. Если, колония на индикаторной среде с лактозой выросла бесцветная, значит на искусственной питательной среде, данный промотор не работал и ген во фрагменте х не экспрессировался. Вероятно, что он нужен только при развитии инфекционного процесса и принадлежит к генам вирулентности. В случае же колоний красного цвета экспрессируется ген, кодирующий образование фермента, расщепляющего лактозу; при этом меняется цвет индикатора и колония окрашивается. Отсюда можно сделать вывод о том, что в данном фрагменте х содержится (вместе с промотором) ген, принадлежащий к house keeping gens, т.е. он экспрессируется всегда: и в организме животного и на искусственной питательной среде. Такой ген в данной случае не представляет интереса. Его можно обнаружить более традиционным путем (для подбора в последующем ингибиторов кодируемого им продукта).

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

Авторы рассмотренного метода (метода IVET) приводят результаты конкретной серии своих экспериментов, в соответствии с которой, на 212.000 колоний красного цвета пришлось только около 2600 колоний неокрашенных. Из клеток E.coli, образовавших эти, последнего типа колонии, было затем выделено около ста генов, принадлежащих к "скрытым" генам салмонеллы (ivi генам). Из них около пятидесяти были новыми, т.е. ранее не описанными, и их продукты представляли интерес как потенциальные таргеты для отбора антимикробных агентов.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 7 8 9 10 Следующая ⇒

Дата публикования: 2015-02-03; Прочитано: 1503 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!

studopedia.org - Студопедия.Орг - 2014-2024 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.053 с)...