Из понятия сущности биотехнологии следует, что основным механизмом получения или модификации лекарственных средств является биообъект

Задача 1

Современная биотехнология решает многие проблемы по созданию новых эффективных и безопасных антибиотических (антибактериальных) лекарственных средств, профилактических препаратов и различных диагностикумов. Современный провизор должен знать биотехнологию в рамках своей профессии, работая на отечественном рынке лекарственных средств, тесно интегрированным с мировым производством лекарственных препаратов.

Номенклатура лекарственных препаратов, полученных на основе биообъектов в силу объективных причин имеет тенденцию к своему расширению. В категорию таких лекарственных препаратов входят:

1. лекарственные средства для лечения, в число которых входят аминокислоты и препараты
на их основе, антибиотики, ферменты, коферменты, кровезаменители и
плазмозаменители, гормоны стероидной и полипептидной природы, алкалоиды;

2. профилактические средства, в число которых входят вакцины, анатоксины, интерфероны,
сыворотки, иммуномодуляторы, нормофлоры;

3. диагностические средства, в число которых входят ферментные и иммунные
диагностикумы, препараты на основе моноклональных антител и иммобилизованных
клеток.

Возможности биотехнологии и ее значение заложены в определении ее, Если эти процессы относятся к биосинтетическим или биокаталитическим, присущим клеткам прокариот и эукариот, когда в качестве элементной базы используются биообъекты для получения целевого (конечного) продукта, то такое производство называют биотехнологическим. Если же в роли целевого (конечного) продукта выступает лекарственное средство, то такая биотехнология называется «биотехнология лекарственных средств».

В настоящее время фармацию характеризует как минимум третья часть лекарственных средств от общего объема производимых лекарств, которая использует современные биотехнологии. Суммируя все позиции определения биотехнологии, указанные выше, можно сказать, что «Биотехнология - это направление научно-технического прогресса, использующее биологические процессы и агенты для целенаправленного воздействия на природу, а также для промышленного получения полезных для человека продуктов, в том числе лекарственных средств».

Биотехнология - комплексная наука, это и наука и сфера производства со своим специфическим аппаратным оформлением. Она позволяет организовать не только рентабельное, экологичное, стабильное и качественное производство лекарственных средств, но и развивать науку на самых ее передовых рубежах: это геномика и протеомика, это сигнально-коммуникативные системы, антисмысловые олигонуклеотиды и.т.д. Биотехнология меняет во всем мире парадигму мышления в поиске и создании новых эффективных и безопасных лекарственных средств. Направление поиска происходит не от клетки к гену, а наоборот, что предопределяет возможности применения генотерапии.

Из понятия сущности биотехнологии следует, что основным механизмом получения или модификации лекарственных средств является биообъект.

Биообъект - это продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо катализатор, фермент, который катализирует присущую ему реакцию. Для использования активно функционирующего биообъекта в интересах биотехнолога при получении ценных биологически активных веществ необходимо знать свойства этого биообъекта с целью его совершенствования. В качестве биообъектов биотехнология использует либо продуценты - микроорганизмы, растения, высшие животные, либо использует изолированные индивидуальные ферменты. Фермент иммобилизируется (закрепляется) на не растворимом носителе, что позволяет его использовать многократно. Современная биотехнология использует такие достижения, как искусственные культуры клеток и тканей. Особое достижение биотехнологии - это генноинженерные продуценты, микроорганизмы, имеющие рекомбинантные ДНК. Ген четко изолируется и вводится клеткам микроорганизма. Этот микроорганизм будет продуцировать вещество, структура которого закодирована во введенном гене. Классификация биообъектов и возможности целевого воздействия на них

1. Макрообъекты: человек, млекопитающие, рептилии, рыбы, насекомые, растения

2. Микрообъекты:

Эукариоты - низшие грибы, водоросли (кроме нитчатых)

Прокариоты - актиномицеты, бактерии, сине-зеленые водоросли.

Микробиосистемы - ферменты, протопласты.

Известно, что сама по себе жизнедеятельность микроорганизма не отвечает интересам биотехнолога в получении достаточно больших количеств ценных лекарственных веществ, поэтому необходимо знать свойства этого биообъекта для дальнейшего его совершенствования. К свойствам биообъекта для его практического совершенствования относится:

Безвредность, устойчивость к фагам и вирусам, активность биосинтеза, скорость роста и накопление биомассы, стабильность по производительности, чувствительность к условиям культивирования (аэрация, рН температура), потребность в источниках углеводов и азота, использование дешевых и доступных питательных сред, соответствие условиям промышленного производства (отсутствие неприятного запаха, не слишком большая вязкость его среды).

Задача 2

Биотехнологическое производство лекарственных средств связано с определенными условиями, из которых первое относится к выбору биообъекта - микроорганизма-продуцента. Этот выбор зависит от конкретных свойств этого биообъекта, таких как: безвредность, устойчивость к фагам и вирусам, активность биосинтеза, скорость роста и накопление биомассы, стабильность по производительности, чувствительность к условиям культивирования (аэрация, рН температура), потребность в источниках углеводов и азота, использование дешевых и доступных питательных сред, соответствие условиям промышленного производства (отсутствие неприятного запаха, не слишком большая вязкость его среды). Кроме того, функциональная активность продуцента будет зависеть и от условий его выращивания (культивирования)- это физические и химические факторы:

1. Температура- бактерии-28°, актиномицеты - 26-28°, грибы- 24°

2. Число оборотов мешалки (для каждого микроорганизма - разное число оборотов, разные
2-х, 3-х, 5-ти ярусные мешалки).

3. Расход подаваемого на аэрацию воздуха.

4. Давление в ферментере

5. рН среды

6. Парциальное давление растворенного в воде кислорода (количество кислорода)

7. Концентрация углекислого газа при выходе из ферментера

8. Биохимические показатели (потребление питательных веществ)

9. Морфологические показатели (цитологические) развитее клеток микроорганизмов, т.е.
надо следить в процессе биосинтеза за их развитием 10. Наличие посторонней микрофлоры

11. Определение в процессе ферментации биологической активности.

Успех биотехнологического производства зависит и от возможности преобразования (модификации) продуцента с целью повышения его активности и это, прежде всего, мутагенез и селекция. Повышение продуктивности микроорганизма как продуцента сводится к селекции и мутагенезу. Селекционная работа с микроорганизмом состоит в поиске природных форм, которые обладают какими-либо полезными для человека свойствами (например, синтез БАВ, высокая скорость роста, способность усваивать дешевые среды и так далее, в дальнейшем совершенствовании его, в создании на его основе промышленных штаммов.

Методы современной селекции - это генетическое конструирование, когда можно изменить генетическую программу микроорганизма.

Генетическое конструирование в живой клетке in vivo включает получение и выделение мутантов с использованием различных способов обмена наследственной информацией живых микробных клеток.

Генетическое конструирование in vitro основано на применении генетической инженерии, которая манипулирует выделенной из организма ДНК. Каждый организм имеет свой генотип и фенотип.

Биотехнолог для совершенствования биообъекта использует:

• наследственные изменения фенотипа, которое передается по наследству;

• наследственное изменение генотипа.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 3

Одним из способов модификации биообъекта с целью усиления его функциональной активности является метод клеточной инженерии Клеточная инженерия - это техника обмена фрагментами ДНК, участками хромосом у прокариот и любыми хромосомами у эукариот, независимо от удаленности организмов в эволюционном плане.

В случае клеточной инженерии нет видовых и родовых барьеров, т.е. в клеточной инженерии осуществляют обмен генетическим материалом между организмами, которые в обычных условиях не вступают в половой процесс, что открывает большие возможности в создании биообъектов.

В случае с клеточной инженерией исследователь оперирует целыми клетками. Техника клеточной инженерии основана на технике протопластирования. Протопласт — это клетка без клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной. Протопласт получают, обрабатывая клетку ферментами, которые гидролизуют полимеры в клеточной стенке.

Техника получения протопласта

Необходимо получить гибридные клетки слиянием прокариотов и эукариотов.

1.Выбор биообъектов: берут биообъект, продуцирующий целевой продукт (например, продуцент цефалоспоринов гриб (эукариот) Acrimonium chrysogenum и с другой стороны биообъект, которому хотят придать свойство продуцировать целевой продукт (например, прокариот Е. coli).

2.Обработка клеточных стенок ферментами.

3.Стабилизация протопластов

Гипертонический раствор, состоящий из 10%-ных маннита, сахарозы, хлорида натрия. Ионная сила раствора такова, что клетка находится в состоянии тургора, но не разрывается.

4.Слияние протопластов.

Слияние протопластов производится в среде ПАВ в полиэтиленгликоле, который нарушает клеточную цитоплазму и ДНК двух протопластов объединяются. Этот процесс происходит постепенно. Для облегчения клетке процесса фузии (слияния) клетку необходимо сделать компетентной. Для этого:

1. обрабатывают клетку тяжелыми металлами

2. производят быструю заморозку и оттаивание клеток

3. обрабатывают клетки ферментами.

При слиянии получается протопласт с двумя наборами хромосом - диплоидный набор (при образовании гибрида происходит рекомбинация ДНК). 5. Регенерация (восстановление клеточной стенки протопласта.

Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с необходимыми компонентами для прокариот и эукариот. При этом происходит восстановление клеточной оболочки. Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на уровне 4-ой стадии

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

включить еще один протопласт, несущий маркер. Маркер - это участок гена,

образующий какой- либо фермент, заявляющий о себе своеобразным путем при

высеве на питательную среду.

В данном случае маркером является Р-лактамаза. В среду добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые содержат Р-лактамазу, расщепляющую его. А так как Р-лактамазу содержат только клетки гибриды, то на среде и вырастают только гибриды. Техника протопластирования может дать как положительные так и отрицательные варианты. При протопластировании наблюдается явление активации молчащих генов. Протопластирование ведет к изменению микроорганизмов, с помощью чего можно достичь совершенствования биообъектов. Техника клеточной генной инженерии 1-ый метод. Метод перегруппировки генов

Внутри клетки есть определенный набор и последовательность генов. При протопластировании идет перегруппировка генов. Также происходит и активация молчащих генов. П-ой метод. Слияние или фузия генов.

Прокариот сливают с эукариотом, образуется рекомбинант, содержащий кусок одного ДНК и другого ДНК. Ш-й метод: Трансформация.

а) клетка с определенным набором генов в ДНК —> живой протопласт без
перегруппипровки генов —> протопласт гибрид-рекомбинант —> клетка

Т

б) выделение изолированной ДНК в пробирке - вектор (это кусок изолированной ДНК,
выделенный из другого микроорганизма (фаг, плазмида)

Если есть клетка и изолированная ДНК с нужным геном (вектор) - вектор может быть в виде фага, плазмиды, вируса, космиды (плазмида+ фаг), то можно включить вектор в изолированный протопласт (т.е. провести трансформацию). При этом образуются «+» продуценты с новыми качествами, но в клетке существуют системы репарации (восстановления) молекулы ДНК и постепенно эти рекомбинанты возвращаются к исходному (дикому) типу. Репарацию преодолевают следующим образом:

1. «+» варианты дополнительно обрабатывают мутагенами для преодоления действия
системы репарации;

2. иммобилизация клеток «+» вариантов.

Для того, чтобы прошла трансформация, необходимо сделать клетку компетентной, т.е.увеличить ее проницаемость. Это достигается следующим образом:

1. воздействовать на клетку ионами тяжелых металлов (цинк, кобальт, литий, магний)

2. воздействовать на клетку ферментами (лизоцим, комплексный фермент виноградной
улитки)

3. быстрое замораживание и оттаивание.

Компетентные клетки легче поглощают вектор, куски ДНК. У них обнажена цитоплазматическая мембрана, которая в некоторых местах выходит на поверхность, и в образующиеся в этих местах окошечки, легко проникает вектор в виде изолированной ДНК,

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

а также в виде фага, вируса, космиды (космида- изолированная ДНК или плазмида+ фаг). При протопластировании и слиянии протопластов может происходить явление амплификации (увеличение) генов - при этом продукция целевого назначения (витаминов, гормонов, антибиотиков) увеличивается. Клетки с амплификацией генов есть «+» вариант.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 3

Одним из способов модификации биообъекта с целью усиления его функциональной активности является метод клеточной инженерии Клеточная инженерия - это техника обмена фрагментами ДНК, участками хромосом у прокариот и любыми хромосомами у эукариот, независимо от удаленности организмов в эволюционном плане.

В случае клеточной инженерии нет видовых и родовых барьеров, т.е. в клеточной инженерии осуществляют обмен генетическим материалом между организмами, которые в обычных условиях не вступают в половой процесс, что открывает большие возможности в создании биообъектов.

В случае с клеточной инженерией исследователь оперирует целыми клетками. Техника клеточной инженерии основана на технике протопластирования. Протопласт — это клетка без клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной. Протопласт получают, обрабатывая клетку ферментами, которые гидролизуют полимеры в клеточной стенке.

Техника получения протопласта

Необходимо получить гибридные клетки слиянием прокариотов и эукариотов.

1.Выбор биообъектов: берут биообъект, продуцирующий целевой продукт (например, продуцент цефалоспоринов гриб (эукариот) Acrimonium chrysogenum и с другой стороны биообъект, которому хотят придать свойство продуцировать целевой продукт (например, прокариот Е. coli).

2.Обработка клеточных стенок ферментами.

3.Стабилизация протопластов

Гипертонический раствор, состоящий из 10%-ных маннита, сахарозы, хлорида натрия. Ионная сила раствора такова, что клетка находится в состоянии тургора, но не разрывается.

4.Слияние протопластов.

Слияние протопластов производится в среде ПАВ в полиэтиленгликоле, который нарушает клеточную цитоплазму и ДНК двух протопластов объединяются. Этот процесс происходит постепенно. Для облегчения клетке процесса фузии (слияния) клетку необходимо сделать компетентной. Для этого:

1. обрабатывают клетку тяжелыми металлами

2. производят быструю заморозку и оттаивание клеток

3. обрабатывают клетки ферментами.

При слиянии получается протопласт с двумя наборами хромосом - диплоидный набор (при образовании гибрида происходит рекомбинация ДНК). 5. Регенерация (восстановление клеточной стенки протопласта.

Полученный гибрид засевают на плотную питательную среду с необходимыми компонентами для прокариот и эукариот. При этом происходит восстановление клеточной оболочки. Для того, чтобы отличить гибридную клетку от негибридной, необходимо на уровне 4-ой стадии

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

включить еще один протопласт, несущий маркер. Маркер - это участок гена,

образующий какой- либо фермент, заявляющий о себе своеобразным путем при

высеве на питательную среду.

В данном случае маркером является Р-лактамаза. В среду добавляют бензилпенициллин и вырастают только те клетки, которые содержат Р-лактамазу, расщепляющую его. А так как Р-лактамазу содержат только клетки гибриды, то на среде и вырастают только гибриды. Техника протопластирования может дать как положительные так и отрицательные варианты. При протопластировании наблюдается явление активации молчащих генов. Протопластирование ведет к изменению микроорганизмов, с помощью чего можно достичь совершенствования биообъектов. Техника клеточной генной инженерии 1-ый метод. Метод перегруппировки генов

Внутри клетки есть определенный набор и последовательность генов. При протопластировании идет перегруппировка генов. Также происходит и активация молчащих генов. П-ой метод. Слияние или фузия генов.

Прокариот сливают с эукариотом, образуется рекомбинант, содержащий кусок одного ДНК и другого ДНК. Ш-й метод: Трансформация.

а) клетка с определенным набором генов в ДНК —> живой протопласт без
перегруппипровки генов —> протопласт гибрид-рекомбинант —> клетка

Т

б) выделение изолированной ДНК в пробирке - вектор (это кусок изолированной ДНК,
выделенный из другого микроорганизма (фаг, плазмида)

Если есть клетка и изолированная ДНК с нужным геном (вектор) - вектор может быть в виде фага, плазмиды, вируса, космиды (плазмида+ фаг), то можно включить вектор в изолированный протопласт (т.е. провести трансформацию). При этом образуются «+» продуценты с новыми качествами, но в клетке существуют системы репарации (восстановления) молекулы ДНК и постепенно эти рекомбинанты возвращаются к исходному (дикому) типу. Репарацию преодолевают следующим образом:

1. «+» варианты дополнительно обрабатывают мутагенами для преодоления действия
системы репарации;

2. иммобилизация клеток «+» вариантов.

Для того, чтобы прошла трансформация, необходимо сделать клетку компетентной, т.е.увеличить ее проницаемость. Это достигается следующим образом:

1. воздействовать на клетку ионами тяжелых металлов (цинк, кобальт, литий, магний)

2. воздействовать на клетку ферментами (лизоцим, комплексный фермент виноградной
улитки)

3. быстрое замораживание и оттаивание.

Компетентные клетки легче поглощают вектор, куски ДНК. У них обнажена цитоплазматическая мембрана, которая в некоторых местах выходит на поверхность, и в образующиеся в этих местах окошечки, легко проникает вектор в виде изолированной ДНК,

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

а также в виде фага, вируса, космиды (космида- изолированная ДНК или плазмида+ фаг). При протопластировании и слиянии протопластов может происходить явление амплификации (увеличение) генов - при этом продукция целевого назначения (витаминов, гормонов, антибиотиков) увеличивается. Клетки с амплификацией генов есть «+» вариант.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 4

Широчайшие возможности для модификации биообъекта с целью повышения его продуктивности является генная инженерия. Биотехнология рекомбинантных белков охватывает производство:гормонов (инсулина)

вакцин (против гепатита) пептидных факторов роста тканей, рекомбинантных интерферонов (они представляют неспецифическую защиту клетки от вирусов и злокачественных образований).На первом месте среди них по значению стоит рекомбинантный инсулин, составляющий около 30% от всего рынка рекомбинантной продукции.

Суть технологии: производят соединение фрагментов ДНК in vitro (в пробирке) с последующим введением изолированной ДНК в живую клетку. Чистая генная инженерия -это техника обмена изолированными фрагментами ДНК. Это происходит с помощью ферментов, которые относятся к эндонуклеазам (например, рестриктазы).

Цели генной инженерии: создание новых продуцентов для выработки новых целевых продуктов (новые лекарственные средства, диагностическе и профилактические препараты).

Необходимые условия для осуществления генной инженерии:

1. Нужен такой биообъект, который способен синтезировать чужеродный белок,
воспринимал бы и передавал генетическую информацию.

2. Организм человека не должен отторгать продукт, синтезированный продуцентом.

3. Клетка должна делиться, необходимо, чтобы гены, продуцирующие целевой продукт у
клеток, образующихся после деления, экспрессировались (работали).

4. Необходимо иметь транспортное устройство для внесения ДНК в клетку продуцента:
вектор в виде плазмид, космиды, фага.

Вектор вводится разными путями:

1. конъюгация - генетический материал клеток при сближении переходит из одной
клетки в другую в виде плазмиды.

2. трансдукция — передача клетке генетического материала через вирус или фаг.

3. трансформация — передача клетке генетического материала изолированной
ДНК, в результате чего изменяется геном. Процесс трансформации - перенос
генетического материала, при котором фрагмент ДНК, выделенный из клетки донора,
поступает в клетку-реципиент

В генной инженерии включение нового гена происходит с помощью фермента рестриктазы.

Рестриктаз в клетке может быть очень много. Рестриктазы разрушают фосфодиэфирные связи между нуклеотидами в строго определенном месте, т.е. они обладают строгой специфичностью, действуя на определенную последовательность нуклеотидов в цепи. После разрыва связей образуются «липкие концы» и в разрывы включаютсч гены с помощью ферментов ДНК-лигаз, которые соединяют нуклеотиды между собой.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

Есог 1- рестриктаза действует в строго определенной последовательности на одну нить ДНК. Другая рестриктаза расщепляет вторую нить ДНК на другом участке. Рестриктазы расщепляют ковалентные фосфодиэфирные связи между нуклеотидами. После расщепления связей образуются «липкие концы» и в место разрыва можно включить ген, который «сшивается с ДНК с помощью ДНК-лигаз. Техника генноинженерного эксперимента (стадии)

1. Получение ДНК чужеродного фрагмента, который необходимо включить (вклеить) в
клетку хозяина. Например, получение ДНК человеческого инсулина.

2. Получение плазмиды из клетки донора

Есть клетка-реципиет (напр. Е. coli) из которой мы получаем плазмиды (это элементарная концевая молекула ДНК в 100-1000 раз меньше хромосомы, существует в бактериальных клетках или клетках прокариот, плазмиды несут ограниченное количество генов (не более 30).

3. Конструированиерекомбинантной плазмиды (вектора)

Вектор - рекомбинат (подготовленная для генно-инженерных манипуляций плазмида или в виде фага или в виде изолированной ДНК или вируса) или часть рекомбинантной ДНК, которая обеспечивает проникновение и дальнейшую репликацию этой ДНК в клетке хозяина. Вектор получают с помощью рестриктазы (разрывает фосфодиэфирные связи в строго определенном месте последовательности оснований нуклнеотидной цепи)

Введение фрагмента ДНК (гена человеческого инсулина в плазмиду клетки реципиента (E.coli): 2 липких конца одного биообъкета и 2 липких конца другого комплементарно воссоединились. Ген инсулина является чужеродным, поэтому может иметь место такое явление как отжиг.

Отжиг - это процесс смещения двух фрагментов ДНК, когджа восстанавливаются только водородные связи и фосфодиэфирные связи не образуются. Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ДНК-лигазы - это ферменты, которые восстанавливают ковалентные фосфодиэфирные связи и таким образом концы однотяжевой линейной молекулы ДНК соединяются с кольцевой молекулой ДНК - плазмидой. Плазмида - это вектор. Так лиганды сшивают, склеивают молекулы ДНК. На этом этапе плазмида называется вектором или транскриптом.

4. Включение вектора в клетку-реципиент (E.coli)

Условием включения вектора в клетку реципиента является то, что цитоплазматическая мембрана ее должна близко подходить к клеточной стенке, когда вектор входит внутрь клетки через окошечки.

5. Отбор гибридных клонов

Посев идет на питательную среду, содержащую, как пример, бензилпенициллин, при этом вырастают клоны клетки E.coli с маркером в гибридной плазмиде.

У эукариот при образовании молекулы м РНК имеет место процесс сплайсинга (от английского splicing- созревание, сращивание). Ген у эукариот представляется не непрерывный, а мозаичной структуры, содержащей наряду с кодирующими, несущими информацию (так называемые экзоны), также некодирующие, не несущие информацию (интроны) последовательности. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза катализирует

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

транскрипцию как экзонов, так и интронов. В процессе сплайсинга интроны с помощью ферментов вырезаются, а экзоны после удаления интронов сращиваются. При этом образуется функционирующая м РНК.

У прокариот процесс образования м РНК идет проще. При помощи РНК-полимеразы идет транскрипция соответствующего гена. Процесс сплайсинга у прокариот отсутствует. Образующаяся в процессе транскрипции молекула м РНК уже способна к функционированию.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 5

Появление новых дисциплин, таких как геномика и протеомика, являющихся современными достижениями в развитии биологии, имеет большое значение в создании новых более эффективных и безопасных лекарственных средств. Название геномика происходит от слова геном, то есть совокупности всех генов организма. Слово протеомика является производным от протеома - под последним подразумевается совокупность всех - структурных и каталитических белков в клетке эукариота или прокариота.

Геномика ставит своей задачей полную генетическую характеристику именно всей клетки: установление количества содержащихся в ней генов и их последовательности, установление количества нуклеотидов в каждом гене, их последовательности, установление функций каждого гена применительно к метаболизму организма или, говоря более общими словами, применительно к его жизнедеятельности. Иными словами геномика позволяет выразить сущность организма - его видовые (и даже индивидуальные) отличия от других организмов, его потенциальные возможности, предвидеть его реакцию на внешние воздействия, зная последовательность нуклеотидов в каждом из его генов и зная число генов. Минимальные геномы у некоторых видов микроорганизмов состоят из нескольких сотен генов. Геном человека приближается к ста тысячам генов. Размеры отдельных генов варьируют - примерно от одной тысячи пар нуклеотидов и выше. Таким образом, количество пар нуклеотидов, составляющих индивидуальный геном измеряется как минимум сотнями тысяч, обычно же многими миллионами пар нуклеотидов.

Отсюда следует, что для полного знания генома организма надо определить последовательность (sequence) миллионов пар (А-Т, Г-Ц) нуклеотидов. Провести "секвенирование", согласно вошедшему в употребление выражению, целого генома можно только при автоматизации соответствующего оборудования. Геномика теснейшим образом связана с биоинформатикой, которая базируется на базах данных и компьютерной технике.

Структурная геномика. Ее задача - идентификация генов с помощью специальных компьютерных программ. Ведется поиск открытых рамок считывания со старт-кодонами и терминирующими кодонами, то есть идентифицируются структурные гены. В результате, изучаемый геном характеризуется по молекулярной массе, количеству генов, нуклеотидной последовательности в каждом гене. У прокариот - в геноме-хромосоме, у эукариот - в каждой из хромосом. Сравнительная геномика позволяет получить сведения о степени гомологии родственных генов (степени гомологии по последовательности нуклеотидов в открытой рамке считывания). Сравнительная геномика дает возможность при систематической работе в этом направлении получить ответ на вопрос об эволюционной близости одного организма другому. Можно также вести поиск ингибиторов данного гена (вернее кодируемого им белкового продукта) у патогенного микроорганизма с целью создания на их основе лекарственных средств, если знать есть ли ген с такой или близкой последовательностью нуклеотидов в организме хозяина. Это позволяет определить степень безопасности создаваемых лекарств. Функциональная или метаболическая геномика имеет цель установить связи между геномом и метаболизмом, кластерами генов и многоступенчатыми метаболическими процессами, отдельными генами и конкретными метаболическими реакциями (здесь также есть

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

специализированные базы данных). В клинике в настоящее время используется порядка ста природных и синтетических антибактериальных веществ. Каждое из них имеет свою мишень. Как правило, это или фермент, или рибосомный белок. Всего реализованных мишеней также около ста.

Генотерапия требует предварительного создания рекомбинантной генетической конструкции с нормальной ("здоровой") копией дефектного гена, а также создания вектора для этой конструкции, переносящего ее в клетки, подвергаемого генотерапии организма.

Наиболее перспективным путем переноса генов при генотерапии пока признается включение их в векторы, построенные на основе ретро-, или адено- вирусов. Вирусы генетически модифицируются так, чтобы при сохранении способности проникать в клетку, они теряли бы способность к автономной репликации. Для направленной доставки сконструированной последовательности принимается во внимание различный тропизм разных вирусов к определенным видам тканей. Так представители аденовирусов высокотропны в отношении клеток эпителия дыхательных путей, вирус герпеса высокотропен в отношении нейронов ЦНС и т.д. Современная генотерапия направлена только на соматические клетки.

Генотерапия ex vivo (вне организма) означает, что нормальная копия гена вводится в соматические клетки, предварительно извлеченные из организма пациента. Исправленные клетки наращиваются и вводятся пациенту путем трансфузии или трансплантации. Рекомендуется для этого использовать клетки именно от больного и их «исправленное» потомство возвращать больному. Это снимает проблему отторжения клеток за счет врожденного иммунитета, но предполагает применение иммуносупрессоров. При генотерапии in vivo доставка нормального гена осуществляется непосредственно в ткани человека (в клетки определенных тканей). К настоящему времени несколько десятков технологий генотерапии различных заболеваний прошли апробацию на тысячах больных и добровольцах (США, Англия, Франция и др.). Имеются сообщения о нескольких случаях возникновения лейкемиеподобных заболеваний, после клинической апробации некоторых технологий генотерапии. Отмечается, что во всех таких случаях использовались векторы на основе ретровирусов. Сообщается также об отдельных случаях, когда введенный ген экспрессировался не столь длительное время как было запланировано.

АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУЮ1ЕОТИДЫ. Известно, что некоторые как наследственные, так и не наследственные заболевания, могут быть связаны не с дефицитом конкретного белка или его дефектом, а, наоборот, с гиперпродукцией нормального функционально активного белка. Отсюда следует задача частичного или полного подавления продукции такого белка с различной вариабельностью. В соответствии с этим была выдвинута концепция создания (в XXI веке) инновационных лекарственных средств, получивших общее название антисмысловые олигонуклеотиды. Предполагается получать комплементарную для ДНК каждого гена (его участка) последовательность нуклеотидов, которая за счет водородных связей будет реагировать с ДНК гена или с информационной РНК, матрицей для которой служит указанная ДНК. В первом случае, подавление образования избыточного белка при связывании с геном будет происходить на стадии транскрипции, а во втором, (при связывании с информационной РНК) -на стадии трансляции. Специфичность антисмысловой последовательности нуклеотидов,

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

(избирательность воздействия на выбранный ген) достигается при длине цепочки 15-20 нуклеотидов (отсюда название олигонуклеотиды). Предлагается модификация таких нуклеотидов в соответствующих лекарственных препаратах, мешающая воздействию на них нуклеаз, но не препятствующая реагированию с ДНК - или РНК-мишенью; а также предлагается «упаковка» этих нуклеотидов в липосомы и т.д.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 6

Антибиотики предназначены для уничтожения микроорганизмов, конкурирующих с продуцентом в почвенных биоценозах (за пита­тельные вещества и т.п.). Антибиотики является эффекторами дифференциации мицелия или спорообразования и гораздо чаще образуются микроорганизмами именно со сложным циклом развития.

Антибиотики являются средством преодоления «стрессовых» ситуаций для продуцента, независимо от того, вызвана ли такая ситуация исчерпанием питательных веществ в результате роста культуры конкурента, или в результате размножения клеток своей же культуры, переходящей в этом случае к спорообразованию. Под названием "антибиотики" ("против жизни") объединены вещества, образуемые микроорганизмами и избирательно подавляющие рост других микроорганизмов. Позднее это понятие было распространено на продукты их химической модификации, что получило отражение в наименовании "полусинтетические антибиотики". Некоторые из антимикробных антибиотиков обладают способностью подавлять рост опухолевых клеток, в связи с чем появился еще один новый термин - противоопухолевые антибиотики. Таким образом, понятие "антибиотики" в настоящее время расширено.

Важнейшая характерная черта антибиотиков - их избирательность действия на метаболизм. Обычно антибиотик из нескольких тысяч метаболических реакций подавляет только одну или несколько. В этом отношении антибиотики противопоставляются антисептикам. В тоже время антибиотики высокоактивны и угнетают рост микроорганизмов в концентрации порядка 1 мкг/мл или меньше. Продуценты антибиотиков. Подавляющее большинство продуцентов антибиотиков выделено из почвы. Однако, есть примеры выделения продуцентов не только из почвенных биоценозов, но и из других мест обитания: ил и придонная морская вода, гниющие растительные продукты и т.д. Всюду, где в значительном количестве обнаруживаются микроорганизмы, можно выявить и продуценты антибиотиков. Скрининг антибиотиков (поиск и отбор) продуцентов ведут в несколько этапов. Если это ненаправленный скрининг (первичный), то происходит отбор наиболее активных микроорганизмов-продуцентов по способности продуцировать антибиотики или другие БАВ. Если это направленный скрининг, то ведется поиск и отбор продуцентов антибиотиков определенного химического строения или с определенным типом по механизму антагонистического действия. Схема выделения включает в себя следующие этапы. Это: 1. приготовление стерильных питательных сред, 2. приготовление почвенной суспензии 3. посев на агаризованную среду, 4. выделение микроорганизмов-продуцентов антибиотиков в виде чистых культур, 5. хранение микроорганизмов-продуцентов и оценка способности их продуцировать антибиотики. Вначале образцы почв многократно разводят водой с таким расчетом, чтобы при высеве на твердые питательные среды в чашках Петри, сплошного роста микроорганизмов не было, а отдельные клетки при инкубации в течение нескольких суток давали бы изолированные друг от друга колонии. Затем отдельные колонии переносятся на среды в пробирках, в результате чего после инкубации вырастают полученные из одной колонии, то есть фактически из одной клетки, штаммы почвенных

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2

микроорганизмов (штамм - культура, выросшая из одной клетки). Далее, различными методами определяется способность каждого из выделенных штаммов быть антагонистом в отношении различных микроорганизмов, то есть образовывать подавляющие рост последних, антибиотические вещества. Антибиотический эффект обычно стараются обнаружить на твердых питательных средах, например, оценивать его по зоне отсутствия роста тех или иных бактерий вокруг посеянного штриховым способом изучаемого штамма, или по зоне отсутствия роста вокруг лунки в агаре, или вокруг впаянного в агар металлического цилиндра (без дна), заполненного культуральной жидкостью исследуемого штамма. К настоящему времени в лабораториях разных стран мира выделены и охарактеризованы сотни тысяч продуцентов антибиотиков. Как правило, продуцентами антибиотиков являются такие почвенные микроорганизмы как плесневые грибы, актиномицеты, спорообразующие бактерии.

Известно, что антибиотики не являются первичными метаболитами. Обычно их структура резко отличается от первичных метаболитов, например, тетрациклины иногда являются аналогами первичных метаболитов (фузидин). Иногда в их молекуле в качестве фрагментов обнаруживаются как необычные для организмов структуры, так и аналоги метаболитов, напри­мер, аминоциклитол и аминосахара у аминогликозидов; макроциклические лактоны и аминосахара у макролидов и полиенов.

Данные по протеомике и геномике имеют большое значение для развития фармации в области антибактериальных веществ. К настоящему времени полностью секвенирован геном нескольких десятков видов бактерий, в том числе патогенных. У разных видов бактерий размер варьирует, но в целом он близок к нескольким тысячам генов и нескольким миллионам пар оснований, соответственно, например, у Escherichia coli - четыре с небольшим тысячи генов и четыре с небольшим миллиона пар оснований.

Большинство генов могут рассматриваться как существенные (то есть, как жизненноважные для бактерий*) и, следовательно, как мишени для антибактериальных веществ. В клинике в настоящее время используется порядка ста природных и синтетических антибактериальных веществ. Каждое из них имеет свою мишень. Как правило, это или фермент, или рибосомный белок. Всего реализованных мишеней также около ста. Следовательно, подавляющее количество генов в качестве мишеней для антибактериальных агентов все еще не используются.

Методы протеомики позволяют получить более полную, всестороннюю, картину взаимодействия с клеткой новых потенциальных антимикробных агентов. Работы по изучению динамики биосинтеза ферментов вторичного метаболизма у микроорганизмов при использовании протеомики могут быть переведены на новый, более высокий уровень. Это непосредственно связано с совершенствованием продукции многочисленных классов лекарственных веществ.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 7

Плесневые грибы образуют сотни различных антибиотиков, однако, в медицинской практике применяются лишь отдельные из них.Важнейшая группа антибиотиков, образуемых грибами -пенициллины и цефалоспорины. Их объединяют под названием беталактамные антибиотики, так как важнейшая часть их молекулы, от которой зависит антимикробная активность, реакционно— способное четырехчленное беталактамное кольцо (циклический амид). Беталактамное кольцо получило свое название ввиду того, что при его образовании происходит замыкание связи между углеродом карбоксильной группы аминокислоты и азотом аминогруппы, находящейся при бетауглеродном атоме. Плесневые или «низшие» мицелиальные грибы отличаются от "высших" грибов отсутствием плодового тела. Плесневые грибы широко распространены в почве. Их относят к микроорганизмам эукариотам, имеющим оформленное, окруженное мембраной ядро. Плесневые грибы имеют также субклеточные структуры -митохондрии, где сосредоточены ферменты, катализирующие биоэнергетические процессы. Клеточная стенка грибов состоит из хитина-полимера, влючающего остатки аминосахара. В целом клетки грибов отличаются сложной организацией и большими размерами по сравнению с бактериальными клетками. Плесневые грибы - многоклеточные микроорганизмы со сложным циклом развития. Они формируют различные виды мицелия (например, воздушный - на поверхности водной среды), спороносцы со спорами и другие морфологические образования. Цикл развития грибов - около 6-7 -ми суток.

Беталактамные антибиотики образуются двумя родами плесневых грибов: Penicillium (отсюда - пенициллины) и Cephalosporium (цефалоспорины).

В настоящее время предпочитают вместо Cephalosporium использовать название Arcemonium. Широко известны два продуцента беталактамов: Penicillium chrysogenium и Acremonium chrysogenium. Первый образует бензилпенициллин, второй - цефалоспорин С. У пенициллинов с беталактамной структурой сконденсировано пятичленное кольцо, содержащее серу, а у цефалоспоринов - шестичленное. Мировое производство пенициллинов и цефалоспоринов достигает десятков тысяч тонн, а стоимость их продукции на мировом рынке - более 12млрд. долларов.

К грибам относится продуцент ещё одного антибиотика, применяемого в медицинской практике. Представитель рода Fusidium, а именно Fusidium coccineum, образует антибиотик стероидной структуры - фузидиевую кислоту или фузидий.

Механизм действия) Ъ-лектамных антибиотиков. Они ингибируют синтез пептидогликана клеточной стенки на последнем этапе, подавляя активность фермента транспептидазы. Транспептидазы соединяют концы пептидных цепочек, на концах которых находится D-аланин, а Ъ-лектамные антибиотики являются аналогами D-аланина и связываются с активным центром фермента, тем самым инактивируя его. В результате пептидные цепочки не замыкаются. Клетка начинает лизироваться или переходит в спорообразование.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2

Должен быть отмечен ещё один весьма ценный лекарственный препарат, образуемый грибами. На рубеже 70-80-х годов из гриба отнесенного к роду Tolypocladium, был выделен циклопептид, проявлявший слабую антимикробную активность, а поэтому "забракованный" как антибиотик. Однако, он оказался высокоэффективным в качестве иммуносупрессора Циклопептид, получивший название циклоспорин (точнее циклослорин А), широко используется сейчас при пересадке органов и тканей, а также при некоторых аутоиммунных заболеваниях.

Антибиотики предназначены для уничтожения микроорганизмов, конкурирующих с продуцентом в почвенных биоценозах (за пита­тельные вещества и т.п.). Антибиотики является эффекторами дифференциации мицелия или спорообразования и гораздо чаще образуются микроорганизмами именно со сложным циклом развития.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 8

Актиномицеты оказались продуцентами огромного количества разнообразных антибиотиков - их насчитается около четырех тысяч. Актиномицетами образуется большинство антибиотиков, применяемых в медицинской практике.Ряд видов, относящихся к родам Streptomyces и Micromonospora образуют (например, Streptomyces griseus и Micromonospora purpurea) антибиотики аминогликозидной структуры, к которым принадлежат: стрептомицин, гентамицин, неомицин, канамицин и ряд других антибиотических веществ с широким спектром антибактериального действия, получивших широкое распространение в клинике.

Название "актиномицеты" отражает распространенное ранее неправильное представление об этих микроорганизмах как о лучистых грибах. Установлено, что актиномицеты стоят гораздо ближе к бактериям, чем к грибам. Они являются прокариотами. Их геном не заключен в ядро, а представляет собой кольцевую хромосому, не отделенную от цитоплазмы ядерной мембраной. Клетки актиномицетов не содержат также и митохондрий. Их клеточная стенка построена из гетерополимера - пептидогликана. Все это сближает актиномицеты с бактериями. Однако, актиномицеты, в отличие от "истинных" бактерий (эубактерий), яв­ляются многоклеточными организмами. Они имеют сложный цикл развития - обычно 5-6 суток, во время которого их мицелий как и у грибов претерпевает дифференциацию - под микроскопом наблюдаются сложные морфологические изменения. Актиномицеты образуют спороносцы и споры. В молекуле аминогликозидов обязательно присутствуют:

1) остаток щестичленного аминоциклитола;

2) остатки Сахаров и/или аминосахаров.

Кроме природных аминогликозидов в медицинской практике в настоящее время используется и полу- синтетические аминогликозидные антибиотики, то есть продукты химической модификации природных аминогликозидов.

Виды, относящиеся к роду Streptomyces (Streptomyces aureofaciens, Streptomyces rimosus и др.) образуют широко известные антибиотики тетрациклиновой структуры: хлортетрациклин, окситетрациклин и тетрациклин. Все они близки по спектру антибактериального действия, все всасываются при приеме внутрь, однако некоторыми преимуществами (лучшей переносимостью) обладает тетрациклин. Они содержат структуру из четырех циклов и различаются только по «верхней», но не по «нижней» периферии молекулы. Верхняя периферия тетрациклиновой молекулы была модифицирована химическим путем, что позволило получить полусинтетические тетрациклины - доксициклин и миноциклин (первый из них длительно цир­кулирует в крови, второй - обладает повышенной антибактериальной активностью).

Широко известны образуемые актиномицетами антибиотики макролидной структуры, содержащие макроциклическое лактонное кольцо и сахара и/или аминосахара. В частности, к ним относится эритромицин - продуцент Streptomyces erythraeus и близкий к нему олеандомицин, образуемый Streptomyces antibioticus. Эти антибиотики хорошо всасываются при приеме внутрь. Они высоко эффективны только против грамположительных бактерий, так как являются антибиотиками узкого спектра действия. Из актиномицета, первоначально названного Streptomyces mediterranei, а позднее отнесенного к виду Nocardia mediterranea, выделены антибиотики сложной анзамициновой структуры. У них имеется нафталиновое "ядро" и длинная

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

алифатическая цепь, соединённая с ароматической частью эфирной и амидной связью. Наибольшую известность из них получил рифампицин (рис.) или рифампин, который является, однако, полусинтетическим антибиотиком. Рифампицин успешно применяется в лечении туберкулеза. Актиномицеты, помимо антибактериальных антибиотиков, образуют также и антибиотики, подавляющие рост грибов и дрожжей, в том числе патогенных. Представители рода Streptomyces, например, Streptomyces nourasei, являются продуцентами противогрибковых антибиотиков, относящихся к полиеновым макролидам. Макроциклическое лактонное кольцо содержит у этих антибиотиков ряд сопряженных двойных связей. Наиболее известны: нистатин (тетраен - диен) и амфотерицин В (гептаен). В молекулу полиеновых антибиотиков входят и аминосахара. Полиеновые антибиотики широко известны в медицинской практике. Вследствие их высокой токсичности полиены применяются, в основном, наружно или перорально.

Нередко при пероральном применении их используют вместе с антибактериальными антибиотиками для того, чтобы предотвратить быстрое размножение дрожжей после подавления роста бактерий. Актиномицеты образуют ряд противоопухолевых антибиотиков. Из них свыше десяти нашли применение при лечении некоторых форм рака. Так, Streptomyces verticillius образует антибиотик блеомицин сложного гликопептидного строения. Наиболее важной в настоящее время считается группа антрациклинов, к которой принадлежат дауномицин, адриамицин и их полусинтетические производные. Продуцентами антрациклинов являются различные виды рода Streptomyces.

Антрациклины содержат структуру частично сходную с таковой у тетрациклинов, а также остаток аминосахара. Ни по спектру антибиотического действия, ни по областям применения в клинике антрациклины и тетрациклины не сходны. Механизм действия аминогликозидных антибиотиков:

аминогликозиды - ингибируют синтез белка у бактерий, связываясь с малой рибосомной субъединицей, нарушая правильность считывания кодонов информационной РНК (иРНК) антикодонами транспортной РНК (тРНК).

Скрининг антибиотиков (поиск и отбор) продуцентов ведут в несколько этапов. Если это ненаправленный скрининг (первичный), то происходит отбор наиболее активных микроорганизмов-продуцентов по способности продуцировать антибиотики или другие БАВ. Если это направленный скрининг, то ведется поиск и отбор продуцентов антибиотиков определенного химического строения или с определенным типом по механизму антагонистического действия. Схема выделения включает в себя следующие этапы. Это: 1. приготовление стерильных питательных сред, 2. приготовление почвенной суспензии 3. посев на агаризованную среду, 4. выделение микроорганизмов-продуцентов антибиотиков в виде чистых культур, 5. хранение микроорганизмов-продуцентов и оценка способности их продуцировать антибиотики. Вначале образцы почв многократно разводят водой с таким расчетом, чтобы при высеве на твердые питательные среды в чашках Петри, сплошного роста микроорганизмов не было, а отдельные клетки при инкубации в течение нескольких суток давали бы изолированные друг от друга колонии. Затем отдельные колонии переносятся на среды в пробирках, в результате чего после инкубации вырастают полученные из одной ко­лонии, то есть фактически из одной клетки, штаммы почвенных микроорганизмов (штамм -культура, выросшая из одной клетки). Далее, различными методами определяется способность

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

каждого из вьщеленных штаммов быть антагонистом в отношении различных микроорганизмов, то есть образовывать подавляющие рост последних, антибиотические вещества. Антибиотический эффект обычно стараются обнаружить на твердых питательных средах, например, оценивать его по зоне отсутствия роста тех или иных бактерий вокруг посеянного штриховым способом изучаемого штамма, или по зоне отсутствия роста вокруг лунки в агаре, или вокруг впаянного в агар металлического цилиндра (без дна), заполненного культуральной жидкостью исследуемого штамма.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 9

Весьма существенную роль играет возможность проведения сравнительной идентификации антибиотиков на начальных этапах исследования в части их функциональной активности, как антибактериальных препаратов. Для непосредственного определения антимикробной активности рекомендован способ биологического титрования, при котором определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде с последующим сравнением размеров зон угнетения роста тест-организмов, образующихся при испытании растворов известных концентраций стандартного образца и испытуемого препарата.

Существуют два варианта этого метода:

1/ ТРЕХДОЗНЫЙ, при котором для проведения анализа готовят по три концентрации растворов стандартного и испытуемого образцов;

2/ ОДНОДОЗНЫЙ с использованием стандартной кривой в полулогарифмической сетке. В чашках Петри с тест-организмом вырезаются лунки /диаметр 8 мм/ или ставятся цилиндрики, в которые вносят пипетками опытные растворы /нативный раствор или экстракт/ стандартные образцы в объеме 0,05 мл. Чашки помещают в термостат при 37°С на 18 часов.

Учет наличия антимикробной активности проводится путем измерения зон подавления роста тест-организма вокруг лунок с испытуемым раствором или вокруг металлических, предварительно стерилизованных цилиндриков, впаянных в агар, в которые вносится раствор.

Параллельно на этой же чашке в другие лунки /цилиндрики/ закапывают стандартные образцы предположительно близкого по действию антибиотика, измеряют и сравнивают зоны подавления роста тест-организма.

Расчет активности при использовании трехдозного варианта метода диффузии в агар осуществляется в соответствии с рекомендациями Государственной фармакопеи.

После завершения стадии ферментации культуральная жидкость передается на выделение антибиотика и его очистку. Культуральная жидкость содержит растворенный антибиотик, мицелий продуцента, продукты его лизиса, ряд компонентов неиспользованной питательной среды, в том числе, высоко- и низкомолекулярных органических веществ и неорганических солей. Иногда антибиотик содержится не только в культуральной жидкости, но и в мицелии. В редких случаях антибиотик содержится только в мицелии. Культуральная жидкость нередко отличается высокой вязкостью. Все это делает задачу выделения антибиотика из столь сложной и гетерогенной системы - не простой. Можно отметить, в историческом аспекте, что именно неудача химиков при выделении и очистке пенициллина отдалила на десятилетие его внедрение в медицинскую практику.

На стадии предварительной очистки ставится задача отделения растворенного антибиотика от суспензии мицелия и компонентов культуральной жидкости, находящихся в коллоидном состоянии. В том случае, если часть антибиотика находится в мицелии, его стремятся перевести в водную фазу меняя, например, рН культуральной жидкости (это используется в случае тетрациклинов) или используя

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

другие приемы. Иногда, наоборот, растворенный антибиотик и антибиотик связанный с мицелием стремятся объединить в общем осадке, из которого антибиотик затем экстрагируют. На стадии предварительной обработки культуральной жидкости нередко используют различные способы коагуляции, флоккуляции. Отделение нативного раствора от мицелия и коллоидных частиц осуществляют методами фильтрации или центрифугирования. Используются барабанные вакуум-фильтры, фильтр-прессы, сепараторы различных конструкций и т.д.

На следующей стадии работы ставится задача получения антибиотика в виде индивидуального вещества. При этом приходится учитывать довольно высокую лабильность многих антибиотиков, что ограничивает условия их выделения.

Принцип экстракции органическим растворителем используется при очистке таких важнейших антибиотиков как пенициллин, эритромицин и некоторых других. При переходе в органический растворитель происходит освобождение соответствующих антибиотиков сразу от многих примесей. Варьируя рН и меняя, таким образом, растворимость антибиотика в воде (точнее буферном растворе), можно многократно переводить антибиотик из одной фазы в другую, освобождаясь, каждый раз от определенного количества примесей. Один из примеров окончания процесса при экстракционном методе выделения и очистки - это извлечение пенициллина из органического растворителя бутилацетата, где он находится в виде свободной кислоты: к бутил-ацетату добавляют насыщенный водный раствор ацетата калия. Выпадает калиевая соль пенициллина. Кристаллы промывают бутанолом и высушивают.

Ионообменные смолы (катиониты и аниониты) широко используются при очистке антибиотиков. Особое значение эти сорбционные методы сыграли в свое время в решении проблемы получения в высокоочищенном виде аминогликозидных антибиотиков стрептомицина и других, имеющих свойства оснований. Аминогликозиды слабо растворимы в органических растворителях и вследствие этого экстракционный метод, применительно к ним не может быть использован. В производстве стрептомицина могут быть, например, успешно использованы карбоксильные катиониты в Na-форме. Десорбция осуществляется раствором серной кислоты. После дополнительной процедуры, связанной с пропусканием стрептомицина через сульфокатионит (для удаления ионов натрия) и некоторыми другими операциями, получают сульфат стрептомицина.

Помимо ставших традиционными экстракционных и сорбционных методов, при выделении и очистке антибиотиков (как и многих других природных веществ) все большее значение приобретает комплекс приемов, объединяемых под названием мембранной технологии. Освоение производства мембран с различными функциональными характеристиками, используемых для разделения сложных смесей, ведет к резким изменениям в технологии получения самых различных продуктов.

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

Количественная оценка антибиотиков использует практически все классические и физико-химические методы анализа. Это титриметрические методы анализа, это оптические методы анализа, это хроматографические методы анализа. Наиболее широко применяется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).