Реакция бласттрансформации лимфоцитов

Контакт лимфоцита с чужеродным антигеном или неспецифическим митогеном сопровождается активацией и реакцией бласттрансформации (РБТЛ), т.е. пролиферацией клетки с переходом малых лимфоцитов в бласты, способных к делению и дальнейшей дифференцировке. Одна бластная клетка может дать клон из 16-64 клеток. РБТЛ сопровождается изменением морфологии и метаболизма клетки с восстановлением синтеза ДНК уже через 1-2 часа, интенсификации синтеза белка, изменением фосфолипидного обмена, проницаемости мембраны для ионов, аминокислот, сахаров, нуклеозидов, что и служит критериями оценки функциональной активности лимфоцитов.

Пролиферативную активность Т-лимфоцитов оценивают по интенсивности синтеза ДНК в ответ на стимуляцию митогеном (ФГА, КонА) или распространенные антигены (туберкулин, аллоантигены). Митогены стимулируют пролиферацию значительной части Т-лимфоцитов, поэтому результат оценивают обычно через 3 суток. Специфические антигены стимулируют пролиферацию только тех Т-лимфоцитов, которые несут TCR-рецептор к ним, поэтому индуцированную антигеном пролиферацию оценивают через 5-7 суток.

Для постановки реакции в асептических условиях из вены берется 5-10 мл крови в пробирку c гепарином (25 ЕД/мл). Содержимое пробирки осторожно перемешивают и оставляют на 60 мин. в термостате при 37°С для осаждения эритроцитов, которое может быть ускорено добавлением декстрана, желатина и др. После инкубации в термостате надосадочный слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отсасывают в отдельную стерильную пробирку и определяют число лейкоцитов в 1 мл. Затем взвесь лейкоци­тов разводят питательной средой 199 (содержащей 200 ЕД пенициллина и 100 ЕД стрептомицина в 1 мл) таким образом, чтобы в 1 мл содержалось 1-2 млн лейкоцитов, 20% аутологичной плазмы и 80% культуральной среды.

Приготовленную лейкоцитарную взвесь разливают в стерильные флаконы по 1 мл, добавляют 0,1 мл предварительно оттитрованного антигена и пропускают газо­вую смесь, содержащую 5% углекислого газа. Флаконы закрывают пробками и по­мещают в термостат при 37°С на 5 - 7 дней. За это время культура лейкоцитов периферической крови освобождается от сегментоядерных лейкоцитов, исключая эозинофилы, и содержит преимущественно одноядерные клетки, которые идентифицируются как малые, средние и большие лимфоциты, бласты, ретикулярные клетки и макрофаги.

Интенсивность РБТЛ оценивается различными методами. Морфологический метод оценки РТМЛ заключается в подсчете в окрашенном мазке активированных клеток-бластов на 1000 клеток и определении их процентного содержания. Клетки, подвергшиеся бласттрансформации, увеличиваются в размерах до 20-40 мкм в диаметре, имеют рыхлое ядро, занимающее большую часть клетки, зернистую базофильную цитоплазму. В ядре различаются ядрышки. Реакция расценивается как положительная, если число активированных клеток составляет не менее 4% от общего числа культивируемых клеток; максимальное число активированных клеток при действии специфического антигена может достигать 35%.

Изотопный метод позволяет определить общую активность культур лимфоцитов путем подсчета включенного в клетки, синтезирующие ДНК, меченного Н³-тимидина, добавляемого в культуральную среду. Результаты обычно выражают в импульсах в минуту (имп/мин) и в виде индекса стимуляции - отношение радиоак­тивности стимулированных и нестимулированных лимфоцитов.

Достоверность РБТЛ проверяется контрольными исследованиями с культурой исследуемых лимфоцитов без добавления антигена (для выявления спонтанной бласттрансформации) и с культурой лимфоцитов здоровых доноров, инкубируемой с соответствующим антигеном.