Выделение фракции мононуклеаров

Метод выделения мононуклеаров основан на разной плавучести различных форменных элементов крови. Применение градиента определенной плотности позволяет отделить мононуклеары (лимфоциты, моноциты, бластные клетки) от эритроцитов и гранулоцитов. Мононуклеары как более легкие клетки располагаются над градиентом плотности в виде беловатого полупрозрачного кольца интерференции, а более тяжелые эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки.

Для выделения лимфоцитов можно использовать как цельную кровь, так и лейковзвесь, полученную при инкубации крови в течение 30 мин при 37^оС для предварительного оседания эритроцитов. Кровь или лейковзвесь осторожно наслаивается на градиент плотности (1,077 г/л) в соотношении 2:1 и центрицугируется в течение 30 мин при 400 g (1500 об/мин). Затем на границе разделения фаз собирают слой мононуклеаров, переносят в другую пробирку и разводят в 3-5 раз фосфатно-солевым буфером (рН 7,2). Клеточную взвесь дважды отмывают при центрифугировании в течение 10 мин при 300 g (1000 об/мин). Концентрация клеток определяется при подсчете в камере Горяева с оценкой жизнеспособности клеток с использованием трипанового синего или эозина Y (краситель не проникает через мембраны живых клеток). Оптимальная для исследования концентрация клеток колеблется в пределах от (0,8 –3,0) х 10⁶/мл при содержании живых клеток в суспензии не менее 95%.