Методы оценки апоптоза

Апоптоз – это программируемая, генетически опосредованная форма клеточной гибели, при которой внешние или внутренние сигналы дают импульс клетке к образованию или активации ферментов, приводящих ее к самоуничтожению. Морфологически апоптоз характеризуется сморщиванием клетки, конденсацией и фрагментацией ядра, разрушением цитоскелета и буллезным выпячиванием клеточной мембраны. Особенностью апоптоза является то, что умирающая клетка сохраняет целостность своей мембраны до полного завершения процесса, и только тогда разрушение ее оболочки является сигналом для расположенных вблизи фагоцитов к поглощению оставшихся фрагментов и завершению процесса клеточной деградации. Апоптотические клетки, не подвергшиеся немедленному фагоцитозу, превращаются в мелкие, связанные с мембраной фрагменты, называемые «апоптотическими телами». Важной чертой апоптоза является то, что удаление умирающих клеток происходит без развития воспаления.

Апоптоз играет важную роль в физиологических процессах: органогенезе, эмбриональном развитии, регуляции состава и численности клеточных популяций в тканях взрослого организма, различного рода гормональных перестройках организма. Важна роль апоптоза и при различных патологических процессах. Наиболее полно она изучена при опухолевом росте.

Процесс апоптоза может быть разделен на две фазы:

· формирование и проведение апоптотических сигналов – фаза принятия решения;

· демонтаж клеточных структур – эффекторная фаза.

Реализация механизмов апоптоза связана с активацией эндогенных клеточных ферментов - цистеиновых протеаз (каспаз). Каспазы находятся в клетках в неактивном состоянии (прокаспазы). Активация происходит путем их протеолитического расщепления и последующей димерезацией с образованием активных субъединиц. Мишенями для каспаз являются белки, отвечающие за различные жизненные функции клетки. В настоящее время описано 14 видов каспаз, которые по функциональным особенностям можно разделить на 3 группы:

· активаторы цитокинов (каспазы 1, 4, 5, 13)

· каспазы - индукторы активации эффекторных каспаз (каспазы 2, 8, 9, 10)

· эффекторные каспазы - исполнители апоптоза (3, 6, 7)

Одним из мембранных клеточных рецепторов, ответственных за механизмы апоптоза, является белок, получивший название Fas-рецептора (CD95/АРО1). Лигандом для Fas-рецептора является белок - Fas-лиганд (Fas-L), который принадлежит к семейству опухольнекротических факторов и может быть представлен как в форме мембранного белка, так и в растворимой форме. Связывание Fas-рецептора с Fas-лигандом приводит к включению механизмов апоптоза с активацией каспаз-индукторов. При последующей активации эффекторных каспаз начинается цепь протеолитических реакций, целью которых является апоптотический «демонтаж» клетки: фрагментация ДНК, прямое расщепление структурных белков клетки, нарушение регуляции белкового синтеза. Таким образом, участие эффекторных каспаз в апоптозе приводит к разрыву апоптотической клетки с окружающими клетками, реорганизации цитоскелета, снижению возможностей репарации и репликации ДНК, разрыв ядерной мембраны и разрушение ДНК, выбросу сигналов, маркирующих клетку для апоптоза, расчленению клетки на апоптотические тельца. Не случайно эффекторные каспазы получили название «каспаз-палачей».

Методы исследования апоптоза достаточно разнообразны. Первоначально наиболее распространенным способом определения апоптоза был электрофорез экстрагируемой фракции ДНК, который позволяет выявить дискретность низкомолекулярной ДНК по мол. массе (как результат межнуклеосомной деградации ДНК). В морфологических исследованиях для выявления разрывов ДНК используют TUNEL-метод, основанный на формировании вставок меченых олигонуклеотидов в участках разрывов ДНК, образование которых катализируется ферментом TdT.

В настоящее время для регистрации апоптоза лимфоцитов все шире применяют методы, основанные на проточной цитофлуориметрии. К этой группе относится метод, основанный на выявлении потери клетками части ДНК (гиподиплоидных клеток) с помощью флуоресцентного красителя - пропидиума йодида, который описан ниже. Для определения апоптоза используются и другие методы, основанные на проточной цитофлуориметрии. Апоптоз лимфоцитов можно обнаружить уже на ранних этапах с помощью меченого флуорохромом аннексина V, который связывается с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток, подвергающихся апоптозу. Ориентировочное представление о «склонности» лимфоцитов к развитию апоптоза можно получить, определяя экспрессию на их поверхности Fas-рецептора (CD95) и в митохондриях – протонкогена bcl-2.

Клиническая значимость оценки апоптоза при клинико-иммунологическом обследовании больных несомненна, поскольку с его нарушением связан целый ряд заболеваний. Ослаблением апоптоза обусловлено формирование аутоиммунных заболеваний (вследствие нарушения процесса выбраковки аутоспецифических клонов лимфоцитов). Поэтому регистрация ослабления апоптоза может служить источником информации о патогенетических механизмах таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, а также аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, основой которого является мутация генов, детерминирующих рецепторы апоптотических сигналов. Нарушение апоптоза является важным механизмом развития злокачественных процессов. В опухолевых клетках часто выявляется мутация гена р53, кодирующего белок, который воспринимает сигнал о наличии нерепарированных разрывов в ДНК и хромосомных мутациях, приводящий к развитию апоптоза. В результате генетически дефектные клетки не выбраковываются и становятся источником формирования опухолей.

При ряде других заболеваний отмечается, наоборот, усиление апоптоза. Это имеет место при инфекционных процессах (причиной массового апоптоза Т-клеток часто являются микробные суперантигены), сепсисе, различных вирусных заболеваниях, в том числе СПИД. Апоптоз усилен при ряде заболеваний крови и первичных иммунодефицитов, когда его причиной является недостаточная выработка факторов выживания клеток, роль которых выполняют цитокины. Так, при одной из форм тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с мутацией гена ИЛ-7 или общей γ-цепи цитокиновых рецепторов, является гибель лимфоидных предшественников вследствие дефицита ИЛ-7.

Однако наиболее общезначимой является оценка «активационного апоптоза», которому подвергаются лимфоциты при их стимуляции митогенами. Дело в том, что апоптоз, наряду с пролиферацией, является формой ответа лимфоцитов на активационные стимулы. На ранних этапах дифференцировки преобладает апоптотический ответ, и его результатом является формирование толерантности к индукторному антигену. Зрелые лимфоциты отвечают на стимуляцию преимущественно пролиферацией (что служит начальным этапом и предпосылкой развития иммунного ответа), но определенная вероятность их вступления в активационный апоптоз сохраняется. Поскольку апоптоз при этом выступает в качестве процесса, альтернативного пролиферации, их соотношение может служить мерой результативности ответа клеток на активирующие сигналы. Чем выше вклад апоптоза в ответ лимфоцитов на митоген, тем менее эффективной будет антигенспецифическая иммунная защита. Таким образом, определение апоптоза при активации лимфоцитов митогенами является наиболее информативным при условии параллельной оценки пролиферативного ответа клеток на тот же стимул.

В процессе апоптоза в клетке происходит сложная цепь реакций на молекулярном уровне, приводящих к изменению обменных процессов и фенотипической характеристики клеток. Эти изменения могут быть определены биохимическим, микроскопическим или цитометрическим методами и используются в качестве маркеров апоптоза.

Одним из ранних маркеров апоптоза является появление на цитоплазматической мембране клетки рецепторов к аннексину. В апоптотических клетках фосфолипид фосфатилдисерин (ФС) переориентируется и локализуется на поверхности клеточной мембраны. Локализация ФС на поверхности мембраны наблюдается начиная с
ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Рекомбинант-
ный аннексин V-белок (35-36 кД), обладающий высокой аффинно-
стью к ФС в присутствии ионов Са⁺². Связываясь с ФС на поверхно-
сти клетки аннексин V, конъюгированный с флуорохромом, служит
маркером апоптоза. Обычно аннексин V используется в комбинации с
пропидием иодидом (PI), что позволяет одновременно распознавать
интактные клетки (отрицательные и по аннексину V, и по PI), клетки,
находящиеся в «раннем» апоптозе (положительные по аннексину V,
отрицательные по PI), и клетки, находящиеся в позднем апоптозе или
в некрозе (положительная и по аннексину V и по PI).

СD95 Fas, или APO-1,- трансмембранный гликопротеин (45 кД), являющийся членом семьи рецепторов к фактору некроза опухолей (TNF-α). CD95 антиген экспрессируется в значительном количестве на тимоцитах, CD4⁺, CD8⁺ лимфоцитах периферической крови, в меньшей степени на В-лимфоцитах и NК-клетках. Этот антиген экспрессируется также на гранулоцитах и моноцитах, но его экспрессия не обнаружена на тромбоцитах и эритроцитах. Рецептор CD95 наблюдается также на клетках нормальных тканей и опухолей. Связывание CD95 Fas-лигандом (Fas-L, CD95L) индуцирует апоптоз в клетках, его экспрессирующих. Моноклональные антитела к CD95 позволяют с использованием метода проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии выявить популяцию клеток, готовых к апоптозу.

CD95L (Fas-L) – называемый Fas-лигандом, является мембранным белком (40кД). Существует также растворимая форма CD95L (sFas-L), которая представляет собой белок (26 кД) из семьи рецепторов (TNF-α). Этот антиген экспрессируется цитотоксическими Е-лимфоцитами и NК-клетками, а также выявлен на многих опухолевых клетках. Связывание Fas-L с рецептором CD95 индуцирует процесс апоптоза в клетках-мишенях. Моноклональные антитела к CD95L позволяют с использованием метода проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии выявить популяцию клеток, готовых к апоптозу.

Bcl-2 – белок (26 кД), оверэкспрессия которого блокирует апоптоз. Bcl-2 – внутриклеточный белок, локализующийся на митохондриях, поэтому для его определения с помощью моноклональных антител необходимо провести предварительную пермеабилизацию мембраны клетки.