Метод непрямой иммунофлуоресценции

Непрямая иммунофлуоресценции – метод, основанный на использовании моноклональных антител, меченных флюорохромом, с оценкой результатов по учету специфического свечения клеток при люминесцентной микроскопии.

Для проведения исследования 25 мкл суспензии мононуклеаров (3х10⁶/мл) вносят в коническую микропробирку, добавляют 10 мкл раствора инактивированной кроличьей сыворотки и ресуспензируют клеточную взвесь. Клетки инкубируют при 18-20^оС в течение 20 мин. Затем в пробирку вносят 20 мкл соответствующих специфических антител в рабочей концентрации и после ресуспензирования инкубируют клеточную взвесь при 4^оС в течение 30 мин. Клетки отмывают фосфатно-забуференным физиологическим раствором при центрифугировании при 400g в течение 5 мин с последующим ресуспензированием в 10 мкл инактивированной кроличьей сыворотки. После инкубации клеток при 4^оС в течение 5 мин в пробирку вносят 20 мкл вторых антител, конъюгированных с флюорохромом. Инкубируют взвесь при 4^оС в течение 30 мин, после чего отмывают клетки повторным центрифугированием при 400g в течение 5 мин. В пробирку вносят 20 мкл 30% глицерина, тщательно перемешивают и переносят взвесь клеток в лунки предметного стекла. Препарат инкубируют во влажной камере при 4^оС в течение 30 мин. При оценке результатов при микроскопии считают не менее 200 клеток, сопоставляя фазово-контрастную и флуоресцентную картины каждого поля зрения, определяя количество клеток, содержащих специфическую флуоресцентную метку.