Технические характеристики 3 страница

На практике, наиболее часто анализируют дифракционное распределение, получаемое в фокальной плоскости объектива, а в качестве измеряемого размера используют линейный размер, соответствующий определенному числу дифракционных лепестков, однозначно связанный со средним размером дифрагирующих частиц.

Рис. 3. 1. Изображение совокупности эритроцитов, полученное с помощью

электронной микроскопии [http://www.mednovosti.ru]

Лазерная дифрактометрия эритроцитов основана на зависимости их геометрических размеров от внешних возмущающих факторов и позволяет измерять оптические и механические характеристики эритроцитов, их способность к агрегации. Наиболее часто в качестве внешнего воздействия используют изменение осмотического равновесия или сдвиговое напряжение, возникающее при течении жидкости.

Для достаточно простого объекта: щель, проволока и т.п. дифракционная картина имеет вид чередующихся вытянутых пятен с убывающей от центра интенсивностью. Если объект круглой формы, то дифракционная картина имеет вид чередующихся концентрических колец с убывающей от центра интенсивностью (см. рис. 3.2).

Рис. 3.2. Дифракционная картина на совокупности красных клеток крови

Лазерные дифракционные измерители позволяют проводить измерение размеров в диапазоне от единиц до сотен микрометров с точностью до десятых долей процента. При этом размер наблюдаемой дифракционной картины может превышать размер эритроцита в 1000 и большее число раз, что позволяет обеспечивать высокую точность измерения и при высокой яркости лазерного излучения визуализацию дифракционной картины на экране большого размера. Относительное изменение среднего размера эритроцитов равно по модулю относительному изменению диаметра дифракционного кольца:

,

где D D и D l – изменения среднего размера эритроцитов и диаметра дифракционного кольца соответственно.

При исследовании эритроцитов используются три вида препаратов: мазок крови, эритроциты в физиологическом растворе и сферулированные.

Дифрактометрический метод измерения размера биологических клеток

Этот метод впервые описал Т. Юнг в 1813 году. Он использовал его для измерения среднего диаметра волокон шерсти и красных клеток крови в сухом образце. Инструмент, который он использовал, был назван «эриометр». При измерении диаметра красных кровяных клеток он получил размер 5 мкм, вместо 7.5 мкм. Его ошибка состояла в том, что он использовал для нахождения диаметра выражение , которое несправедливо для круглых объектов и в качестве излучения использовал полихроматическое излучение (белый свет). В то время метод не получил дальнейшего развития и был забыт.

Вновь к нему обратились только в начале XX столетия и первоначально повторили основную ошибку Т. Юнга и только в 1926 году для измерения диаметра эритроцитов использовали формулу для дифракции на непрозрачных дисках , где k для первого минимума было принято равным 1.22, а для второго 2.23. В это же время было найдено, что данные дифрактометрии достаточно хорошо согласуются с результатами, полученными фотографическим способом. Ошибка составила ± 0.2 мкм.

С помощью дифрактометрического метода было найдено, что при сушке красной клетки ее диаметр уменьшается примерно на 1 мкм и к 1928 г. все основные трудности были решены за исключением измерений в плазме. Однако примерно в это же время развитие проблемы приняло новый аспект. К этому времени накопилось достаточно много данных об отношении среднего диаметра эритроцита человека и животного и об изменении диаметра эритроцита в зависимости от разных патологических и физиологических условий. В 20-е годы прошлого столетия этим активно занимался Prince-Jones.

В гематологии основная характеристика патологий эритроцитов может быть более объективно выражена в терминах объема, чем в терминах диаметра. Смещение интереса от измерения диаметра к измерению объема в итоге привело к тому, что была предпринята попытка дифрактометрического измерения объема клетки, учитывая возможность трансформации формы эритроцита от дискоцита к сфероциту без изменения объема. Но здесь опять возникли определенные трудности. Строго говоря, нельзя просто перейти от модели дифракции на диске к дифракции на сфере, да еще прозрачной.

Другим существенным фактором является наличие дисперсии эритроцитов по размерам. Существовавшие на тот момент источники монохроматического излучения (ртутные лампы) и практическое отсутствие фотоэлектрических приемников излучения существенно затрудняли практическую реализацию дифрактометров. Нахождение максимумов и минимумов дифракционной картины осуществлялось либо визуально, используя зрительную трубу либо предварительно регистрируя изображение дифракционной картины на фотопластинке.

Дифрактометрический метод можно считать одним из наиболее точных для измерения объема клетки. Но нужно исходить из того, что в данный момент все клетки имеют сферическую форму. Эту неопределенность можно уменьшить, используя специальные химические препараты (distearyl lecithin, sodium tetradecyl sulphate и т.п.). Тогда же было замечено, что наличие анизоцитоза проявляется в дифракционной картине в уменьшении ее контраста. Происходит изменение интенсивности в максимумах и минимумах дифракционной картины. Но, используя данное обстоятельство, можно пытаться найти распределение эритроцитов по размерам – построить кривую Прайс-Джонса.

Использование дифракционного метода для исследования эритроцитов проводилось и в СССР. В 1955 г. Лемажихин Б.К. и Франк Г.М. провели работу по определению размеров эритроцитов методом дифракции света в связи с проблемой биологического действия ионизирующей радиации.

Основная цель, которую авторы ставили в работе: можно ли при помощи дифракции с достаточной точностью определить средние размеры эритроцитов и попытаться хотя бы приближенно подойти к характеристике анизоцитоза. В работе измерялся диаметр первого и второго порядков дифракции на саморегистрирующем микрофотометре. Диаметр эритроцитов определялся по формуле

,

где l- длина волны источника, n – порядок спектра дифракции, a - средний диаметр эритроцитов и j - угол дифракции. По оценке авторов в образовании ДК участвовало около 50 тыс. эритроцитов.

Для измерения параметров дифракционной картины авторы предложили схему дифрактометра, основанную на изменении масштаба ДК (рис. 3.3).

В 60-е годы с появлением лазеров дифрактометрия вновь обратила на себя внимание как метод, позволяющий измерять объекты с большой точностью. Высокая пространственная когерентность и монохроматичность источника излучения позволяли с большой точностью восстанавливать диаметр объекта по дифракционной картине. В последние годы появилось значительное число работ, посвященных изучению свойств эритроцитов, в частности их геометрических и механических свойств, с помощью дифрактометрии.

Лазерная дифрактометрия мазков крови

Одним из наиболее распространенных объектов исследования состояния крови является мазок. Приготовление качественного мазка крови (получение областей равномерно распределенных эритроцитов в виде монослоя) является достаточно сложной процедурой, требующей хороших навыков. Большинство выполнявшихся ранее исследований были проведены на мазках крови (рис. 3.4). Мазок по длине должен получиться достаточно неоднородным и для экспериментального наблюдения за размерами и формой эритроцитов, а также при дифрактометрии используют ту часть мазка, где эритроциты образуют монослой. Обычно это область конца (хвостика) мазка.

Использование мазков в дифрактометрии позволяет судить о деформируемости эритроцитов и нахождении функции распределения эритроцитов по размерам.

В практическом большинстве работ при рассмотрении дифракции на эритроците предполагается, что он имеет дискоидную форму, и в качестве его модели используют приближение теневого сечения, хотя достаточная обоснованность данного приближения отсутствует.

При принятии отдельным эритроцитом или их совокупностью эллиптической формы, ДК тоже становится эллиптической, но эллипс ДК разворачивается относительно эллипса исходного объекта на 90⁰, поскольку размер дифракционного кольца связан с размером эритроцита обратно пропорциональной зависимостью. Взаимосвязь формы эритроцита и вида ДК позволяет измерять деформируемость эритроцитов.

Контроль изменения размера и формы эритроцитов может проводиться с использованием лазерного телевизионного дифрактометра (рис. 3.5).

В рамках исследования характера изменения совокупности эритроцитов, проводившегося на стандартных мазках цельной крови при помощи микроскопа и дифрактометрически, обследовано 18 больных множественной миеломой (ММ) и 6 больных апластической анемией (АА) в динамике (исходно; после завершения курса лечения и через 1,5 - 3,0 мес). Всего обработано 56 образцов крови больных ММ и 15 мазков крови больных АА. Контрольную группу составили 16 доноров.

Мазки крови просматривались под микроскопом и по стандартной методике определялся средний размер эритроцитов, строилась кривая Прайс-Джонса. Затем эти мазки переносились на дифрактометр и проводилось измерение ее параметров.

Одновременно, регистрируемое сечение ДК наблюдалось на экране осциллографа, что позволяло более объективно следить за качественным изменением ДК. Качество ДК зависит от мазка (степени анизоцитоза, формы эритроцитов, наличия разрушенных элементов клеток крови и т.п.) и может условно оцениваться числом наблюдаемых дифракционных колец. С увеличением степени анизоцитоза число наблюдаемых дифракционных колец уменьшается. В процессе измерения мазок крови поворачивался на угол до 90⁰, что приводило и к аналогичному развороту ДК, и позволяло измерять ее в двух ортогональных и нескольких промежуточных сечениях. Таким образом, мы имели возможность измерять среднюю эллиптичность совокупности эритроцитов.

При исследовании мазков крови доноров (контрольная группа) эллиптичности эритроцитов обнаружить не удалось. В то же время иная картина зарегистрирована при изучении мазков крови больных ММ (таблица 6), а именно: у всех больных выявлялась эллиптичность красных клеток крови.

Таблица 6

Изменения белка и геометрии эритроцитов в процессе лечения больных ММ

Показатели больных	Общий белок, г/л	Эллиптич- ность	Размер эритроцита, мкм
Микроскоп	Дифрактометр
Исходный	100 ± 3	4.6 ± 0.2	8.3 ± 0.5	8.0 ± 0.2
После курса лечения	85 ± 3	2.4 ± 0.2	8.2 ± 0.5	7.9 ± 0.2

Визуально в процессе контроля за ДК на экране монитора и по осциллограммам у больных ММ после применения различных программ химиотерапии, в большинстве случаев, наблюдалась тенденция к ухудшению ДК (уменьшение контраста и числа наблюдаемых дифракционных колец). Однако в дальнейшем отмечалось улучшение ДК (увеличение контраста). Такой характер изменения ДК можно объяснить существенным изменением структуры крови, обусловленной распадом клеток и парапротеина на фоне осуществления больным цитостатического лечения, что вызывает ригидность эритроцитарных мембран и ухудшение текучести крови.

Следовательно, показатель эллиптичности может служить одним из независимых маркеров эффективности лечения больных ММ и отражать динамику течения этого заболевания.

Численная оценка размера сечения ДК в разных направлениях выявила наличие эллиптичности в пределах от 9 % до десятых долей процента. В процессе лечения после курса химиотерапии и сеансов ПА величина эллиптичности уменьшалась. Анализируя мазки крови при последующих поступлениях больных через 1.5 ‑ 3 месяца следует отметить увеличение эллиптичности, причем в отдельных случаях, до исходной величины, что коррелировало с ростом концентрации общего белка и парапротеина в сыворотке крови этих больных и указывало на недостаточную эффективность проведенных курсов химиотерапии. Появление ориентированной эллиптичности эритроцитов на мазке крови, вероятно, можно объяснить их деформируемостью, которая зависит как от внешних, так и от внутренних факторов.

В лабораторных исследованиях эритроцитов, при наличии направленного сдвигового усилия, возникающего при приготовлении мазка путем растягивания капли крови предметным стеклом, возможно вытягивание эритроцитов в направлении действия силы при наличии значительной вязкости плазмы крови за счет повышенного содержания белка и парапротеина, а также за счет ослабления упругих свойств оболочки эритроцитов. В результате этого они принимают эллиптическую форму.

Сравнение данных измерения среднего размера эритроцитов методами микроскопии и дифрактометрии у доноров и больных обеих групп показало, то разброс показаний по данным микроскопии примерно в два раза выше чем при дифрактометрии и составляет примерно 14 %. Время измерения одного образца при дифрактометрии не более 1-2 минут, при этом при дифрактометрии усреднение осуществляется по (1 – 1,5)×10³ эритроцитов. Таким образом, предлагаемая методика определения размера и эллиптичности эритроцитов путем дифрактометрии мазков позволяет ускорить исследование и дает более точную информацию по сравнению с микроскопическим методом. Использование этого метода позволит сравнительно легко и своевременно диагностировать реологические расстройства при целом ряде заболеваний системы крови.

3.2. Дифрактометрия агрегации эритроцитов

Агрегация эритроцитов – один из важнейших реологических показателей крови – играет определяющую роль в патогенезе различных гематологических заболеваний и сопровождающих их осложнений. Наряду с такими функциями как обеспечение крови текучести, транспортировки продуктов обмена веществ и газов, увеличении скорости движения эритроцитов, агрегация способствует нарушению микроциркуляции, увеличению вязкости крови, повышению кровяного давления и т.д. В связи с этим представляет интерес разработка методов, позволяющих быстро и точно определять агрегатное состояние крови.

На основе анализа результатов микроскопического исследования рассмотрена модель дифракции лазерного излучения на агрегированных эритроцитах.

Приближения, используемые при дифрактометрии эритроцитов

Эритроциты в крови здорового человека преимущественно имеют двояковогнутую дискоидную форму. В силу их малой средней толщины (~2 мкм) при изучении явления дифракции можно считать эритроциты плоскими экранами – это такие объекты, геометрическими размерами которых в направлении облучения можно пренебречь. При рассмотрении дифракционных задач говорят об «одномерных» и «двумерных» объектах. В данном случае эти понятия относятся не непосредственно к объектам контроля, а к их теневым проекциям. При этом одномерность подразумевает, что в области контроля проекция объекта не имеет границы по одной из координат. В качестве критерия в дифракционных задачах обычно принимают, что характерный размер отверстия (экрана) , где λ – длина волны излучения, Н – протяженность экрана в направлении распространения излучения (глубина отверстия).

Геометрическая модель формы монетного столбика

В образце крови эритроциты, суспензированные в собственной плазме крови, агрегируют. При проведении эксперимента регистрация ДК производится непосредственно после извлечения образца из влажной камеры. В этом случае в образце преобладают отдельно лежащие монетные столбики (эритроциты соединенные друг с другом своими вогнутыми сторонами) (рис. 3.6) и свободные эритроциты. При разработке модели объекта будем предполагать, что в процессе агрегации образуются только линейные колончатые структуры по типу «монетных столбиков».

Монетный столбик представляет собой совокупность эритроцитов, соединенных друг с другом по плоскости. Форму каждого одиночного эритроцита в поперечном сечении, в этом случае, можно рассматривать как частицу, состоящую из прямоугольника и двух полудисков, а монетный столбик как их совокупность (рис. 3.7).

Для изучения влияния особенностей предлагаемой формы эритроцитарных агрегатов на вид дифракционного распределения был проведен численный эксперимент. Рассматривались следующие модели: прямоугольник, описанный вокруг монетного столбика, вписанный в него, и прямоугольник среднего размера (проходящий через середину выступов) (рис. 3.8).

В ДК от монетного столбика, моделируемого совокупностью прямоугольников и полу дисков, наблюдается модуляция, связанная с выступами. Но на положение экстремальных точек функции рассеяния она практически никакого влияния не оказывает. Некоторое различие наблюдается только в контрасте горизонтального сечения ДК, что может быть связано с тем, что монетный столбик состоит из большого числа элементов – прямоугольника и полудисков. Периоды ДК и положения минимумов функции рассеяния совпадают как для монетного столбика, так и для вписанного в него прямоугольника с точностью до 0,01 %.

Для получения равномерного распределения интенсивности проводят усреднение ДК по углу. Интегральные сечения для ДК, полученных для монетного столбика и прямоугольника практически идентичны (рис. 3.9 б). Это может быть связано с тем, что соотношение площадей прямоугольника и полудиска (r – радиус полудиска, h, b – высота и ширина прямоугольника соответственно).

Таким образом, можно предполагать, что достаточно хорошей моделью монетного столбика при использовании дифракционного метода является цилиндр, охватывающий основное тело монетного столбика. Его теневое сечение – прямоугольник.

Моделирование агрегации эритроцитов

При моделировании дифракции лазерного излучения на эритроцитах будем использовать приближение дифракции Фраунгофера.

При агрегации в образце наблюдаются хаотически расположенные монетные столбики и свободные эритроциты. Все эти объекты имеют теневое сечение либо прямоугольного, либо круглого вида, и их протяженностью в направлении облучения можно пренебречь. Таким образом, объектом дифракции является совокупность прямоугольников и круглых дисков, расположенных и ориентированных в плоскости, перпендикулярной оси пучка, случайным образом, как по углу, так и на плоскости. На формирование дифракционного распределения оказывают влияние в основном три характерных размера: длина монетного столбика (h), его ширина (b) и диаметр свободного эритроцита (d).

Был построен ряд моделей объектов дифракции для различной степени агрегации от 0% до 100% с шагом 5% (рис. 3.10). Общее число эритроцитов во всех моделях было фиксировано и равнялось 500. Высота монетных столбиков была принята одинаковой и соответствовала 10 эритроцитам. Дисперсность по ширине и высоте монетных столбиков и размеру свободных эритроцитов не учитывалась.

В силу случайного расположения и ориентации по углу большого числа однотипных объектов на плоскости распределение интенсивности в фокальной плоскости имеет кольцевую структуру. В центральной части распределения возникает пик интенсивности, величина которого пропорциональна N² (N – число источников). Вокруг очень яркого центрального пятна распределяется остальная часть дифрагированного света, обусловленная дифракцией на частицах. Эта часть дифракционного изображения представляет собой спекл-структуру.

В процессе численного моделирования ДК исследовалось влияние характерных размеров монетных столбиков на положение минимумов интенсивности функции рассеяния и интенсивность центрального лепестка.

Основным элементом структуры ДК от прямоугольной апертуры, в соответствии с ГТД, являются яркие «лучи», формируемые прямолинейными участками контура (рис. 3.11). Число таких лучей равно числу граней контура, и они ориентированы вдоль нормалей к ним. Ширина лучей обратно пропорциональна длинам соответствующих сторон прямоугольника, а координаты минимумов ДК обратно пропорциональны соответствующим размерам апертуры.

При случайной ориентации по углу множества прямоугольных апертур ДК принимает кольцевую структуру (рис. 3.11). Дифракция на таком объекте в силу интерференции большого числа дифракционных волн приводит к возникновению спекловой структуры, промодулированной ДК.

Для получения усредненной характеристики поля и уменьшения влияния спекл-структуры ДК результирующее распределение интенсивности интегрируют по углу.

Таким образом, ДК модели монетного столбика имеет ярко выраженную лучевую структуру (рис. 3.11). Интенсивность ее лучей значительно больше интенсивности ДК от эритроцита, поскольку «лучи» сконцентрированы в ограниченной области ДК.

Характерные размеры монетного столбика существенно отличаются друг от друга. Его ширина значительно меньше его длины (b << h). Следовательно, пространственный период ДК, соответствующий длине, значительно меньше пространственного периода ДК, соответствующего ширине. Поэтому в пределах дифракционного лепестка, соответствующего ширине монетного столбика, укладывается несколько периодов, соответствующих его длине (рис. 3.12). При этом амплитуды, соответствующие одинаковым порядкам дифракционных лепестков, должны быть равны.

Поэтому при суммировании по углу дифрагированных волн, соответствующих ширине и длине монетного столбика основное влияние на модуляцию ДК оказывают дифракционные волны, соответствующие длине монетных столбиков.

Усреднение по углу (суммирование) приводит к уменьшению контраста результирующей ДК. Но сечение усредненной ДК несет на себе следы модуляции соответствующих пространственных периодов. При этом низкочастотная модуляция, соответствующая пространственному периоду ДК, обусловленному дифракцией на «ширине» монетного столбика, проявляется более отчетливо, что, вероятно, можно объяснить различной шириной дифрагированных лучей.

Проанализируем влияние числа объектов на характер результирующего распределения. Случайная ориентация приводит к возникновению спекловой картины. В результате суммирования спекловой картины характерная модуляция, соответствующая длине монетного столбика, еще больше сглаживается, и результирующее сечение ДК становится более гладким (рис. 3.13). Для наглядности влияния числа объектов на «сглаживание» функции мы сместили графики друг относительно друга по оси ординат.

При небольшом числе объектов сглаживание дифракционного распределения наблюдается только в пределах первого дифракционного лепестка (рис. 3.13). По мере увеличения числа объектов функция рассеяния приобретает более регулярную структуру и на дальних порядках дифракции. Это, вероятно, связано с тем, что в области первого дифракционного лепестка в силу конечной ширины лучей дифрагированных волн, они перекрываются более сильно.

Поэтому, при увеличении числа объектов «заполнение» диафрагированными лучами ДК происходит быстрее в дифракционных кольцах, ближайших к центру.

В соответствии с этим, после интегрирования основное влияние на суммарную ДК должна оказывать компонента ДК, соответствующая дифракции на характерном размере ‑ ширине монетного столбика.

Основываясь на результатах анализа интегральной ДК модели монетного столбика, было высказано предположение, что изменение координаты первого минимума при дифракции на модельном объекте, содержащем отдельные эритроциты (диски) и монетные столбики при их случайном взаимном расположении по углу и положению должно быть связано со степенью агрегации (рис. 3.14).

В случае нулевой агрегации (все эритроциты свободны, что возможно в растворе NaCl) координата минимума u соответствует положению дифракционного минимума круглой частицы (1,22π) – объект представляет собой только совокупность дисков. В случае модели полной агрегации эритроцитов – объект представляет собой только совокупность прямоугольников – координата минимума u соответствует ширине монетного столбика, в безразмерных координатах она равна π (рис. 3.14). Изменение степени агрегации «сдвигает» координату первого минимума ДК в пределах от u/π = 1 до 1,22.

Зависимость координаты первого минимума интегральной ДК от степени агрегации имеет квадратичный характер: Х(u)=a₀ + a₁u + a₂u² (рис. 3.15). Коэффициенты а₀, а₁, а₂, можно определить по методу наименьших квадратов.

Относительная чувствительность степени агрегации:

.

Наибольшая величина чувствительности достигается при низкой степени агрегации (45 %) и стремится к нулю при 100 % агрегации (рис. 3.16).

3.3. Использование сил светового давления для исследования физических параметров микрообъектов

Одним из значимых достижений лазерной физики является неконтактная манипуляция микрочастицами с помощью лазерного излучения. Впервые возможность захвата и перемещения микрочастиц сфокусированным лазерным излучением была продемонстрирована А. Эшкиным и соавторами в 1970 г.

Использование различных схем, использующих световое давление, позволяет прилагать к частицам силы до 100 пН, что делает лазерное излучение идеальным инструментом для применения в различных областях науки и техники, в частности, для изучения биологических частиц и заряженных частиц в коллоидных растворах.

Предположение о том, что свет может оказывать механическое давление на вещество, впервые высказал немецкий астроном Иоганн Кеплер в 17 веке. Это предположение он сделал, исходя из результатов своих наблюдений за хвостами комет. Несмотря на то, что световое давление позже оказалось не единственным механизмом этого явления, идея Кеплера оказалась плодотворной для развития астрономии. Например, было показано, что световое (радиационное давление) ‑ один из самых главных механизмов, которые отвечают за динамику частиц в межзвездном пространстве.

Корпускулярная теория света, предложенная Ньютоном, сделала идею светового давления более правдоподобной и стимулировала многочисленные попытки его экспериментального измерения.

В 1873 году Джеймс Максвелл рассчитал значение светового давления с помощью своей теории электромагнитных явлений. Этот эффект был экспериментально измерен в 1910 году российским физиком Петром Лебедевым, который продемонстрировал, что свет оказывает давление на тела.

После создания лазера появился источник излучения достаточно мощный и с максимально коллимированным световым пучком для манипуляции микроскопическими объектами. Но только в 1970 году описание действие сил, связанных с рассеянием и градиентами интенсивности света, на частицы микронных размеров было опубликовано в научной литературе Артуром Эшкиным (англ. Arthur Ashkin), сотрудником Bell Labs.

В настоящее время методы оптической манипуляции микрочастицами нашли широкое применение в биологических и медицинских исследованиях. С помощью лазерного пинцета реализован индуцированный синтез клетки, микрооперации в иммунологии и молекулярной генетике, исследовано движение хромосом. Также с помощью лазерного пинцета исследуют эластичные свойства биообъектов, например, молекул ДНК, эритроцитов.